烏腺金絲桃抗心律失常有效部位的化學成分研究

李冀，閆東，潘若凡，曹明明

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

1 實驗材料與儀器

1．1 藥材與藥品

烏腺金絲桃:采于大興安嶺山區(qū)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學王振月教授鑒定為藤黃科金絲桃屬植物［1－2］;甲酸(色譜純，美國迪馬公司);甲醇(色譜純 美國迪馬公司);水為重蒸水;硅膠(青島海洋化工廠，140～200目，200～300目);色譜層析用化學試劑為分析純(天津試劑一廠);顯色劑:10%的H2SO4乙醇溶液;試劑:NaCl、KCl、CaCl2、KH2PO4、MgSO4·2H2O、NaHCO3、CHCl3(哈爾濱市化學試劑公司)。

1．2 實驗儀器

高效液相色譜儀(Waters 2695);數(shù)據(jù)工作站(Waters Empower軟件);電子分析天平(日本島津AUW220D);超聲波清洗器(上海能信科學儀器有限公司CQ2500型);恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司);色譜柱(Diamonsil C18，250mm ×4．6mm，5μm);Langendorff灌流系統(tǒng)(成都泰盟儀器有限公司)。

2 實驗方法

2．1 柱前處理

取正丁醇萃取物干粉60g，用適量甲醇溶解，拌入80目柱色譜硅膠90g，低溫烘干得黃色粉末，待上層析柱用。

2．2 洗脫劑的選擇

通過薄層色譜的方法尋找硅膠柱色譜的洗脫劑和用于流分檢查時的色譜條件，取少量正丁醇萃取物用甲醇溶解，選用氯仿和甲醇的不同比例進行薄層層析，確定氯仿:甲醇=50∶1可以作為最初的起始溶劑，根據(jù)展開結(jié)果依次配置氯仿:甲醇=50∶1;30∶1;20∶1;10∶1;5∶1;3∶1;1∶1 及純甲醇等洗脫劑。

2．3 裝層析柱

選用(直徑11cm，高150cm)玻璃柱，用氯仿泡硅膠(200～300目)3kg，加適量氯仿于空柱中，打開活塞，調(diào)整氯仿滴速約為4滴/s，在攪拌下快速將泡好的硅膠注入柱中(一次性注入，可以減少氣泡的產(chǎn)生)，反復利用氯仿沖洗硅膠柱，直到氯仿層不下降為止(大約需要2天)，備用。

2．4 層析過程

待層析柱中硅膠沉降好后，打開活塞放氯仿至液面為2～3cm處，將準備好的樣品加入柱頂，為了防止破壞柱頂硅膠平面，樣品應沿柱壁慢慢加入，待樣品全部平整的鋪于柱頂，靜置12h后，即可打開活塞進行不同梯度洗脫。

2．5 樣品收集

按編號收集層析柱流分，每瓶接樣500mL，回收洗脫劑，通過薄層色譜進行檢識，合并薄層層析斑點一致的流分，共有8個流分(Fr．1～Fr．8)。減壓濃縮至干。稱重 Fr．1(0．34g)，F(xiàn)r．2(0．45g)，F(xiàn)r．3(0．57g)，F(xiàn)r．4(0．18g)，F(xiàn)r．5(0．26g)，F(xiàn)r．6(0．48g)，F(xiàn)r．7(0．54g)，F(xiàn)r．8(90．13g)，將蒸干后的樣品少許分別用少量二甲基亞砜溶解，再加入適量生理鹽水進行稀釋。

3 離體心臟灌流實驗

3．1 實驗材料

3．1．1 實驗藥物

受試藥物:合并的 8 個流分(Fr．1 ～Fr．8)。

3．1．2 試劑

氯化鈣(上海源葉生物技術(shù)公司，批號100105);烏頭堿(上海源葉生物技術(shù)公司，批號200909)。

3．1．3 實驗動物

SD大鼠54只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心提供，許可證號:SYXK黑2011001。

3．2 實驗方法

3．2．1 實驗分組

將54只大鼠按體質(zhì)量隨機分為9組，每組6只，包括合并的8個流分(Fr．1～Fr．8)組，模型組。流分組每組給藥劑量0.03mg/ml、模型組給予等量注射用生理鹽水。

3．2．2 造模方法

烏頭堿、氯化鈣誘發(fā)的大鼠離體心臟心律失常模型。用Langendorff灌注系統(tǒng)給大鼠心臟離體灌流，大鼠用乙醚麻醉，麻醉后迅速開胸取出心臟，置于預先準備好的(0～4℃)K－H液中，輕輕擠壓心臟，排出心臟內(nèi)剩余的血液，插管結(jié)扎固定，迅速移至Langendorff灌注系統(tǒng)，以配制的K－H氏液恒壓灌注，灌注液充以VO2∶VCO2=95∶5混合氣體充分飽和，壓力負荷固定于70cm水柱高度，灌流量速度10ml/min左右，灌流系統(tǒng)及心臟周圍溫度，以恒溫水浴維持在(37±0.5)℃。左心耳處剪一切口，插入前端帶水囊的塑膠管，經(jīng)左心房、二尖瓣插入左心室，由壓力傳感器連接Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)，通過計算機自動采樣分析記錄，待心臟活動平衡穩(wěn)定后，灌注烏頭堿(生理鹽水配制)溶液30μg/kg或0．1%的氯化鈣溶液2mg/kg。

3．2．3 用Langendorff灌注系統(tǒng)給藥

藥物持續(xù)于心臟復跳穩(wěn)定后的整個實驗過程。整個實驗過程中持續(xù)觀測左心室最大心室內(nèi)壓(LVSP)、左心室內(nèi)壓最大變化速率(±dP/dt)max和心率(HR)，檢測其恢復時間和持續(xù)時間。

3．3 統(tǒng)計學處理

3．4 實驗結(jié)果

實驗結(jié)果如表1、2 所示，與模型組比較，F(xiàn)r．3、Fr．6、Fr．7組均可延長氯化鈣和烏頭堿發(fā)大鼠快速型心律失常的出現(xiàn)時間，縮短心律失常的持續(xù)時間，差異具有統(tǒng)計學意義，P ＜0．01。

表1 各流分對烏頭堿誘發(fā)離體心臟心律失常出現(xiàn)時間和持續(xù)時間影響(±s)

表1 各流分對烏頭堿誘發(fā)離體心臟心律失常出現(xiàn)時間和持續(xù)時間影響(±s)

注:與模型組比較，＊＊P ＜0．01。

組別 n出現(xiàn)時間(S)持續(xù)時間(min)6 2．21 ±0．63 51．69 ±9．35 Fr．1 組 6 2．68 ±0．52 43．27 ±7．52 Fr．2 組 6 2．42 ±0．41 44．35 ±8．89 Fr．3 組 6 3．98 ±1．13＊＊ 29．59 ±8．55＊＊Fr．4 組 6 2．13 ±0．82 47．65 ±7．45 Fr．5 組 6 2．37 ±0．62 42．98 ±9．76 Fr．6 組 6 3．74 ±0．67＊＊ 32．75 ±6．34＊＊Fr．7 組 6 3．58 ±0．94＊＊ 34．25 ±8．67＊＊Fr．8 組模型組6 2．67 ±0．62 50．75 ±9．02

表2 各流分對氯化鈣誘發(fā)離體心臟心律失常出現(xiàn)時間和持續(xù)時間影響(±s)

表2 各流分對氯化鈣誘發(fā)離體心臟心律失常出現(xiàn)時間和持續(xù)時間影響(±s)

注:與模型組比較，＊＊P ＜0．01。

6 1．75 ±0．52 36．47 ±8．56 Fr．1 組 6 2．46 ±0．41 28．62 ±6．31 Fr．2 組 6 2．04 ±0．29 29．87 ±8．51 Fr．3 組 6 3．51 ±1．04＊＊ 18．47 ±7．34＊＊Fr．4 組 6 1．95 ±0．73 32．76 ±7．67 Fr．5 組 6 1．97 ±0．54 27．69 ±8．24 Fr．6 組 6 3．32 ±0．53＊＊ 17．98 ±7．46＊＊Fr．7 組 6 3．16 ±0．87＊＊ 19．68 ±8．59＊＊Fr．8 組模型組6 2．04 ±0．57 34．73 ±8．64

4 再次硅膠柱層析

Fr．3、Fr．6、Fr．7 組再次硅膠柱層析并通過 HPLC色譜，進行成分分析，篩選出成分相對單純的藥物組分，A(氯仿:甲醇 =20∶1中的1～20瓶組分)，B(氯仿:甲醇=3∶1中的11～20瓶組分)，C(氯仿:甲醇=1∶1中的1～22瓶組分)。

A、B、C三個組分通過薄層色譜的方法尋找硅膠柱色譜的洗脫劑和用于流分檢查時的色譜條件，取以上三種組分少量用甲醇溶解，選用氯仿和甲醇的不同比例進行薄層層析，確定出A組分的初始洗脫劑(氯仿:甲醇=15∶1)，B和C組分的初始洗脫劑(氯仿:甲醇=5∶1，再加少量水)。按編號收集層析柱流分，每瓶接樣500mL，回收洗脫劑，通過薄層色譜進行檢識，合并薄層層析斑點一致的流分，減壓濃縮至干。

5 HPLC檢測組分

儀器:高效液相色譜儀(Waters 2695);熒光檢測器;色譜柱:(Diamonsil C18，250mm × 4．6mm，5μm);Shim－pack保護柱;流動相:甲醇∶水(20∶80);柱溫:18C;檢測波長:365nm。

將經(jīng)過硅膠柱層析后合并出來的組分通過HPLC色譜，進行成分分析，篩選出藥物組分，分別為化合物1(Fr．Ⅰ中的8～19瓶組分)，化合物2(Fr．Ⅲ中的35至最后的組分)。見圖1、圖2。

圖1 化合物1的HPLC色譜圖

圖2 化合物2的HPLC色譜圖

6 鑒定

制備型HPLC和重結(jié)晶相結(jié)合的方法進行單體分離，共得2個到單體化合物。

6．1 化合物1結(jié)構(gòu)鑒定

黃色粉末，mp．235～241℃。HCl－Mg反應呈陽性，Molish反應呈陽性。化合物1經(jīng)酸水解薄層色譜僅檢出D－半乳糖。化合物1的13C－NMR譜中在δ∶101．8(CH)，75．8(CH)，73．0(CH)，71．0(CH)，67.8(CH)和67．0(CH2)處可觀察到一組歸屬于l個半乳糖基的6個碳信號。并有C譜可知化合物1中歸屬于苷元部分的碳信號共為15個，以上表明化合物1為一個半乳糖黃酮苷類化合物。化合物1的1HNMR譜中歸屬于B環(huán)的3個質(zhì)子為7．63(1H，d，J=2．0Hz)處的 H－2'，7．70(1H，dd，J=2．0，7．0Hz)處的H－6'和6．89(1H，d，J=7．0Hz)處的 H－5'，由以上 3個質(zhì)子的偶合情況可知該黃酮化合物的B環(huán)為3'，4'－二氧取代;歸屬于A環(huán)的質(zhì)子為6．27(1H，d，J=2.0Hz)處的 H－6 和6．49(1H，d，J=2．0Hz)處 H－8，由以上2個質(zhì)子的化學位移和偶合情況可推知該黃酮化合物的A環(huán)為5，7－二氧取代。化合物1的1HNMR 中在5．40(1H，d，J=8．0Hz)處還可觀察到歸屬于半乳糖端基質(zhì)子的信號，根據(jù)其偶合常數(shù)(J=8.0Hz)推斷化合物1的糖苷鍵構(gòu)型為β－構(gòu)型。

綜上所述，將此化合物的1H－NMR譜中的主要質(zhì)子信號和13C－NMR譜中的所有碳信號綜合分析，均進行了歸屬，并與相關(guān)文獻的已知化合物A(金絲桃苷)相比較，發(fā)現(xiàn)兩者相應的氫和碳的化學位移基本一致。因此，鑒定化合物1為金絲桃苷(Hyperin)。見表3。

6．2 化合物2結(jié)構(gòu)鑒定

淡黃色粉末，紫外燈下顯黃色熒光。Molish反應陽性，鹽酸鎂粉反應紅色，二氯氧鋯反應加枸櫞酸后黃色褪去，表明可能是黃酮類化合物。推測其為黃酮苷類化合物。

在1H－NMR(DMSO－d6，600MHz)中，歸屬于苷元部分A環(huán)的母核質(zhì)子只有2個，即δ6．18(1H，d，J=2．4Hz)處的 H－6 和 δ6．37(1H，d，J=1．8Hz)處的 H－8，可推斷其A環(huán)為5，7位二取代;歸屬于苷元部分B 環(huán)的母核質(zhì)子有3 個，即 δ7．52(1H，d，J=1．8Hz)處的 H－2'，δ7．54(1H，dd，J=2．4，7．8Hz)處的 H－6'和δ6．83(1H，d，J=7．8Hz)處的 H－5'，組成一個 ABX偶合系統(tǒng)，可推測其B環(huán)為1'，3'，4'位三取代。此外在低場區(qū)可見 δ12．59(1H，s)，δ10．81(1H，br．s)，δ 9．64(1H，br．s)，δ9．16(1H，br．s)處有4 個酚羥基質(zhì)子信號。在高場區(qū) δ0．98(3H，d，J=6．0Hz)處出現(xiàn)了歸屬于L－鼠李糖C－6?位的甲基質(zhì)子信號。還可見δ5．33(1H，d，J=7．2Hz)處歸屬于 D－葡萄糖端基的質(zhì)子信號和δ4．40(1H，s)處歸屬于L－鼠李糖端基質(zhì)子的信號，根據(jù)它們的端基質(zhì)子的耦合常數(shù)，可推斷葡萄糖苷鍵為β構(gòu)型，鼠李糖苷鍵為α構(gòu)型。

Table．3 1H 和13C－NMR Data of Compound 1 and A(in DMSO－d6)

Table．4 1H和13C－NMR Data of Compound 2 and B(in DMSO－d6)

在13C－NMR(DMSO－d6，150MHz)譜中給出了27個碳信號，其中包括歸屬于黃酮母核的15個碳信號(C 環(huán):δ156．6、133．3、177．3，A 環(huán):δ161．2、98．7、164．1、93．6、156．4、103．9，B 環(huán):δ121．2、116．2、148.4、144．7、115．6、121．6);歸屬于葡萄糖的 6 個碳信號(101．2、74．0、76．4、69．9、75．9、67．0);歸屬于鼠李糖的 6 個碳信號(100．7、70．4、70．5、71．8、68．2、17.7);其中葡萄糖基的6位碳原子的化學位移為δ67．0，據(jù)此可推知鼠李糖基是連接于葡萄糖的6位上。化合物2的13C－NMR數(shù)據(jù)見Table．2。

綜上所述，將此化合物的1H－NMR譜中的主要質(zhì)子信號和13C－NMR譜中的所有碳信號綜合分析，均進行了歸屬，并與相關(guān)文獻的已知化合物B(蘆丁)［3］相比較，發(fā)現(xiàn)兩者相應的氫和碳的化學位移基本一致。因此，鑒定化合物2為蘆丁(rutin)。

［1］ 李冀，曹明明，高彥宇．烏腺金絲桃與丹參配伍對心肌缺血模型動物影響的研究［J］．中醫(yī)藥學報，2012，40(1):17－19．

［2］ 馬育軒，王艷麗，周海純，等．烏腺金絲桃的化學成分及藥理作用研究進展［J］．中醫(yī)藥學報，2012，40(6):125－126．

［3］ 楊秀偉．中草藥化學成分的研究［J］．中草藥，2007，30(7):47－49．