涼血通瘀方對出血性中風患者外周血TNF－α、HSP70、NO及NOS的影響

黃艷，周肸，趙鳳鳴，吳勉華，周學平，王明艷

(南京中醫藥大學，江蘇 南京 210029)

出血性中風是臨床常見的急危重癥，急性期若有效治療能很好的控制病情，降低病死率和致殘率。國醫大師周仲瑛教授創制的涼血通瘀法臨床治療出血性中風急性期瘀熱阻竅證患者，療效明顯［1］。涼血通瘀方主要由熟大黃、水牛角、赤芍、丹皮等中藥組成。前期研究結果表明，涼血通瘀方能改善急性出血性中風患者凝血和炎癥相關指標。為了探究涼血通瘀方治療急性出血性中風的分子機制，本文在前期臨床研究的基礎上，進一步通過體外實驗，觀察了涼血通瘀方對TNF－α、HSP70、NO 及 NOS的影響。

1 實驗材料及儀器

1．1 實驗用藥

涼血通瘀方:熟大黃，水牛角、赤芍、丹皮等藥材均購自南京中醫藥大學門診部，由南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定，符合《中國藥典》2005年版標準。

含藥血清的制備:藥液浸泡1h，水牛角先煎，所有藥材煎煮30min后過濾1次，剩余藥液加水煎煮30min，取濾液，合并2次濾液濃縮至55ml(濃度為2g/ml)。20只清潔級大鼠(體質量250g左右，雌雄各半)，隨機分成正常空白對照組，高、中、低劑量組，連續灌胃3天，最后1次灌胃后1h取血，分離血清，滅活，過濾，分裝，－20℃保存備用。

藥液制備:取水牛角泡30min，加10倍量蒸餾水煎煮沸騰后20min，加入熟大黃，赤芍，丹皮，生地黃，廣地龍，三七等，加10倍量蒸餾水煎煮沸騰后20min，過濾，倒出藥液，藥渣加入10倍量蒸餾水煎煮沸騰后20min，過濾，合并2次濾液，濃縮至220ml作為原液，置4℃冰箱保存［2］。原液用單倍稀釋，分為兩個用藥組，其濃度分別為3000ug/ml(臨床等效量)、300ug/ml，空白對照組用生理鹽水。

1．2 試劑

TNF－α ELISA試劑盒(美國RND公司);HSP－70 ELISA試劑盒(USCNLIFE);NO、NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20120328)，RPMI 1640 培養基(Gibco公司);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司產品);PHA(上海澤龍生物工程有限公司，批號20115102)。

1．3 儀器

3111 型CO2 培養箱(FORMA SCIENTIFIC公司);IX50 倒置顯微鏡(Olympus公司);Micropat Reader550型酶聯免疫檢測儀(日本，Bio－Rad公司);LD4－2A離心機(北京醫用離心機廠);HHW21．CU 600 電熱恒溫水溫箱(上海醫用恒溫設備廠);超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)。

2 實驗方法

2．1 臨床病例選擇

臨床病例遵循知情同意原則納入，診斷標準符合《中風病診斷療效評定標準》［3］及《各類腦血管疾病的診斷要點》［4］。

2．2 樣本采集

取患者全血置含有肝素的離心管。

2．3 全血培養

取新鮮抗凝血接種到6 孔板，每孔0．4ml，4ml 1640 全培，PHA 0．2 ml，5%CO237℃培養箱培養 48h，加藥0．51ml，5%CO2，37℃培養箱培養24h，收集上清。

2．4 ELISA法檢測相關細胞因子TNF－α、HSP70

準備試劑、樣品盒標準品，加入準備好的樣品、標準品以及酶聯親和物，37℃反應60min，洗板5次，加入顯色液 A/B室溫避光反應15min，加入終止液，30min內用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)，作標準曲線換算所測細胞因子含量。

2．5 試劑盒測NO及NOS

依照試劑盒說明書上要求分別配制各檢測試劑，按操作表順序分別加樣。上清加樣量100μL。完成程序后，用分光光度計進行比色，NO檢測波長550nm，NOS檢測波長530nm，將所得數據按說明書上所提供的公式分別計算上清中NO、NOS水平。

NO(umol/l)=(測定管吸光度－空白管吸光度)/(標準管吸光度－空白管吸光度)×標準品濃度(100umol/l)×樣品測試前稀釋倍數

總NOS(u/ml)=(總測定管OD值－空白管OD值)/呈色物納摩爾消光系數×(反應液總體積/取樣量)×1/(比色光徑×反應時間)/1000

2．6 統計學處理 實驗所得數據采用SPSS 11．5 軟件進行組間t檢驗，統計處理后結果見表1、2。

3 結果

3．1 涼血通瘀方對外周血中 TNF－α、HSP－70的影響

涼血通瘀方藥液組和空白對照組相比，TNF－α的含量下降，其中藥液3000組(終濃度為300ug/ml)的TNF－α含量明顯下降(P＜0．05);含藥血清高、中、低三個劑量組和空白血清對照組相比，TNF－α的含量皆下降，而HSP－70的含量升高，其中三個劑量組TNF－α的含量都明顯下降(P＜0．05)，中劑量組和低劑量組HSP－70的含量明顯升高(P＜0.05)。見表1。

3．2 涼血通瘀方對外周血中NO及NOS的影響

涼血通瘀方藥液3000組(終濃度為300ug/ml)和空白對照組相比，NOS活性和NO含量均明顯升高(P＜0．05);含藥血清高、中、低三個劑量組和空白血清對照組相比，NOS活性和NO含量均明顯升高(P＜0.05)。見表2。

表1 涼血通瘀方作用后外周血中TNF－α、HSP70的含量(±s，n=4)

表1 涼血通瘀方作用后外周血中TNF－α、HSP70的含量(±s，n=4)

注:與空白對照組比較，*P＜0．05;與空白血清對照組比較，△P＜0．05。

95．49 ±8．8 3．12 ±1．17藥液300 89．76 ±22．36 2．50 ±2．55藥液3000 80．94 ±8．77* 2．27 ±0．61空白血清對照組 102．24 ±4．57 5．02 ±0．68高劑量組 89．79±6．07△ 6．92±2．57中劑量組 94．34±5．27△ 6．15±1．15△低劑量組 89．91±2．67△ 7．46±0．47空白對照組△

表2 涼血通瘀方作用后外周血中NO、NOS的含量(±s)

表2 涼血通瘀方作用后外周血中NO、NOS的含量(±s)

注:與空白對照組比較，*P＜0．05;與空白血清對照組比較，△P＜0．05。

93．55 ±8．11 0．31 ±0．11藥液300 107．18 ±11．37藥液3000 124．47 ±12．72* 1．46 ±0．83*空白血清對照組 105．6 ±16．29 0．49 ±0．17高劑量組 157．0 ±9．41△中劑量組 142．05±17．36△ 0．94±0．37△低劑量組 132．96 ±11．52空白對照組△

4 討論

本實驗結果顯示，涼血通瘀方的藥液和含藥血清都可一定程度的降低出血性中風患者外周血中TNF－α的表達。TNF是一種重要的免疫調節和促炎癥細胞因子，TNF－α為其主要亞型，主要由單核巨噬細胞產生［5］。很多研究顯示，腦出血后TNF－α會升高。史福平［6］等研究結果顯示，腦出血患者血漿TNF－α水平明顯高于正常對照組。楊清［7］等研究結果顯示，急性腦血管病患者血清TNF－α含量明顯高于正常對照組。廖鑫［8］等研究結果表明，高血壓性腦出血患者血清炎癥因子TNF－α的水平顯著升高。還有研究顯示，機體內高水平的TNF－α可直接損傷血管的內皮細胞，造成血管內皮功能失調［9］。前期有臨床實驗提示，涼血通瘀方對出血性中風患者TNF－α的表達有影響，通過本實驗的結果，進一步推測，涼血通瘀方可能通過作用于外周血中的單核細胞，降低了TNF－α的表達，減輕了機體炎性反應導致的“熱”。

涼血通瘀方含藥血清低劑量組和中劑量組都能使HSP70 表達顯著增加。HSP70 是一種進化上高度保守的細胞應激蛋白，存在于細菌到人類的各種生物中。在腦出血等應急狀態下，當其他蛋白合成受抑制時，HSP70 表達反而增加［10］。HSP70 具有保護腦細胞從而具有增加腦細胞對缺血、缺氧的耐受性，抵抗進一步致死性損傷的作用。有研究表明，HSPs在氧化應激的過程中調控蛋白質的合成起著重要作用［11］。本實驗結果提示，涼血通瘀方可能通過增加HSP70的表達對神經細胞發揮一定的保護作用。

涼血通瘀方含藥血清可使NO及NOS表達升高。有關NO與腦出血的研究已引起了人們的重視，但大多仍限于實驗研究［12］，臨床研究較少，對于中醫藥與NO研究也較少，故加強對NO的研究工作有利于進一步深入了解腦出血的發病機理。前期課題組已進行了NO及NOS的相關研究，研究表明，涼血通瘀方可在一定程度上增強NOS活性，促進NO的分泌［13］，本實驗進一步驗證涼血通瘀方對NO及NOS的影響。也進一步驗證了前期的臨床實驗結果，提示涼血通瘀方降低TNF－α，升高HSP70，促進NO和NOS的表達可能是其治療出血性中風的作用機理之一。

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