龜貞地黃飲對性早熟大鼠性腺發育的影響

孫麗英，于秋爽，胡曉陽，陳寶忠，馬育軒，高微，秦鵬飛，張亮

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

性早熟是由于兒童發育提前以致各激素水平升高，性激素的分泌增加，致使第二性征過早的出現。目前認為，女子在8歲前第二性征發育或9歲前月經來潮，男子在9歲前開始性發育，即可診斷為性早熟［1］。

正常青春期啟動和性早熟發生時，卵巢黃體出現率、大鼠的卵巢指數、子宮指數均會增大，子宮壁增厚。卵巢黃體的出現是卵巢發生排卵的直接證據，是卵巢、子宮功能活動的證據，故可以通過觀察雌鼠的卵巢、子宮等性器官的組織學檢查，借以判定大鼠的性早熟情況。

1 實驗材料

1．1 實驗動物

取60只清潔級雌性SD大鼠，喂養24日齡時斷奶，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK20080001(黑)。正常喂食飼料和自由飲水。在通風、溫度、濕度適宜的動物室內，常規、適應性飼養1周。

1．2 實驗藥物

龜貞地黃飲:熟地黃24g，龜板12g，山藥12g，山茱萸12g，女貞子12g，茯苓、澤瀉、牡丹皮各9g，知母6g，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室提供。

1．3 實驗儀器

移液器(Gilson公司);光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司生產);AL204 電子天平［梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司］;臺式離心機(德國EPPENDORF公司);電熱恒溫水浴鍋(北京長風儀器儀表廠)。

2 實驗方法

2．1 溶液配制 NMA:40mg/kg，溶于0．2ml生理鹽水中;中藥高劑量，30ml/kg;中藥中劑量，15ml/kg;中藥低劑量組，7．5ml/kg。

2．2 模型制備、分組方法、給藥方法

參照前期研究結果［1，2］。

2．3 取材方法

經陰道涂片檢查，在確定出現了第一個動情前期時，將該模型組大鼠處死，其余各組按1:1 比例同時用頸椎脫臼法處死大鼠。馬上開腹，取出雙側卵巢和子宮，用電子天平稱量卵巢和子宮的濕重后，將卵巢放入10%甲醛溶液中固定，4℃保存，以備組織病理學檢查。

3 觀察指標及測定方法

3．1 陰道細胞涂片

將消毒的細棉簽(自制棉簽)用生理鹽水濕潤，輕輕插入大鼠陰道內，慢慢轉動兩下取出，把帶有陰道內含物的棉簽在載玻片上均勻轉動做成涂片，酒精燈烘干后，用堿性美蘭溶液染色5 min后，用蒸餾水沖去多余染液，放到顯微鏡下觀察。并根據大鼠陰道涂片細胞變化明確大鼠所處性周期階段。見表1。

表1 大鼠發情各期陰道細胞涂片表現

3．2 子宮指數和卵巢指數

臟器指數=器官濕重/體重，卵巢指數和子宮指數計算公式如下［2］:

再次，山東省雖然不是資源集中地，卻是當之無愧的中國復合肥發展的前沿陣地和市場先行者。山東臨沂臨沭縣作為“中國復合肥之鄉”，大批復合肥企業齊聚于此，形成了完備的市場體系，相關附加產業的發展也十分完善，原料、人才、運輸、銷售各方面優勢均十分明顯，倍豐鹽湖農業科技坐落于此，占據了地理優勢。

3．3 卵巢黃體出現率

3．3．1 組織固定及石蠟包埋［3］

把卵巢放入10%中性甲醛溶液固定。切取卵巢組織塊約4mm，流水沖洗，然后常規脫水至透明，進而浸蠟、包埋、切片。

3．3．2 蘇木精－伊紅(HE)染色

蠟塊切片后常規處理，行HE染色，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。光鏡下觀察各組大鼠雙側卵巢黃體的出現情況，黃體出現率為每個卵巢出現的黃體個數［2］。

4 實驗結果

4．1 陰道細胞涂片

圖1 發情期(×100)

圖2 發情后Ⅰ期(×100)

圖3 發情后Ⅱ期(×100)

圖4 發情間期(×100)

圖5 發情前期(×100)

4．2 子宮指數和卵巢指數 見表2。

表2 各組大鼠的子宮指數和卵巢指數比較(±s)

表2 各組大鼠的子宮指數和卵巢指數比較(±s)

注:與模型組比較，#P ＞0．05，★P ＜0．05。

空白組 10 1．15 ±0．15★ 0．44 ±0．10★模型組 10 2．55 ±0．94 0．70 ±0．62西藥組 10 1．41 ±0．49★ 0．46 ±0．10★中低組 10 2．48 ±0．83# 0．72 ±0．13#中中組 10 1．31 ±0．27★ 0．53 ±0．49★中高組 10 1．45 ±0．55★ 0．49 ±0．65★

結果顯示，中低組與模型組子宮指數、卵巢指數比較無顯著性差異(P＞0．05);空白組、西藥組、中高組、中中組與模型組大鼠子宮指數、卵巢指數比較有統計學意義(P＜0．05);空白組、西藥組、中高組、中中組之間比較子宮指數、卵巢指數無顯著性差異(P＞0．05)。

4．3 卵巢黃體出現率 見表3。

表3 各組大鼠的卵巢黃體出現率比較(±s)

表3 各組大鼠的卵巢黃體出現率比較(±s)

注:與模型組比較，#P ＞0．05，★P ＜0．01。

空白組 10 0．75 ±0．96★模型組 10 4．00 ±0．82西藥組 10 1．25 ±0．96★中低組 10 3．75 ±0．50#中中組 10 2．00 ±0．82★中高組 10 1．00 ±0．82★

結果顯示，中低組與模型組卵巢黃體出現率比較無顯著性差異(P＞0．05);空白組、西藥組、中高組、中中組與模型組大鼠卵巢黃體出現率比較有統計學意義(P＜0．01);空白組、西藥組、中高組、中中組之間比較卵巢黃體出現率無顯著性差異(P＞0．05)。

5 討論

大鼠處于發情周期的不同階段，陰道粘膜也會隨之發生不同的變化。陰道粘膜上皮直接受卵巢內分泌功能的影響，故對雌激素的反應較為敏感，所以通過觀察陰道細胞涂片可準確地了解卵巢的功能，判定其性周期的變化和第一個發情間期。由于陰道涂片法判定大鼠性周期具有簡便、準確、實用等優點，故此法是目前常用的判定大鼠性周期的方法。

大鼠涂陰道涂片，進一步驗證NMA誘導的雌性大鼠性早熟模型是真性性早熟模型。

實驗結果顯示，中藥高劑量組、中藥中劑量組的子宮指數、卵巢指數均小于模型組，且有統計學意義(P＜0．01);同時與空白組比較無顯著性差異(P＞0.05)，表明龜貞地黃飲能夠在一定程度上減少子宮指數、卵巢指數，抑制卵巢黃體的出現，從而也提示龜貞地黃飲能使大鼠的性腺發育和功能狀態維持在正常青春前期水平。

［1］ 孫麗英，高微，胡曉陽，等．中醫學對兒童性早熟病因病機的認識［J］．中醫藥學報，2012，40(4):10－11．

［2］ 孫麗英，于秋爽，胡曉陽，等．龜貞地黃飲對性早熟模型大鼠LH、E2含量的影響［J］．中醫藥學報，2012，40(6):18－19．

［3］ 孫青．滋陰瀉火方干預真性性早熟模型大鼠的實驗研究［D］．南京:東南大學，2006．