中西醫(yī)結(jié)合對(duì)急性腦出血大鼠腦組織NSE、S100 表達(dá)的研究

梁群，趙慧芳，朱永志

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血，屬于中醫(yī)學(xué)中出血性中風(fēng)，是一種常見病、多發(fā)病，已經(jīng)證實(shí)其患病率、致殘率及病死率均有所上升。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)腦出血主要是對(duì)癥、支持治療，如脫水降顱壓，防治腦組織細(xì)胞水腫等，其預(yù)后效果并不理想。本研究主要是通過觀察中風(fēng)1號(hào)湯劑對(duì)急性腦出血大鼠的神經(jīng)缺損功能以及改善腦水腫癥狀的作用，并測(cè)定在中藥干預(yù)后，NSE及S100 mRNA濃度的變化，探討中風(fēng)1號(hào)治療急性腦出血的療效，為中西醫(yī)結(jié)合治療急性腦出血提供一定的參考。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠30只，體質(zhì)量(200±15)g，均為雄性，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1．2 主要儀器及試劑

50ul及100ul微量進(jìn)樣器、大鼠灌胃器(上海佳安儀器廠);大鼠腦立體定向儀(北京博大泰克公司);電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);手持式牙科鉆(上海齒科醫(yī)械廠);大鼠斷頭器、大鼠腦切片模具(湖北省黃石市醫(yī)療器械廠);Olympus DX40 光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);光學(xué)顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司);電熱恒溫箱(WMK－02型);DY－1型水平電泳儀、ZF－1型紫外線透射反射分析儀(重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);GIS數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(北京聯(lián)想有限公司);即用型SABC免疫組化染色試劑盒(上海惠普公司);NSE兔抗鼠單克隆抗體、S100 兔抗鼠單克隆抗體和POLY－L－LYSINE(多聚賴氨酸)(北京中杉公司);DAB顯色試劑盒、PBS緩沖液和磷酸緩沖液和總RNA快速提取試劑盒(上海惠普公司)。

中風(fēng)1號(hào)主要是由黃芪、川芎、當(dāng)歸等中藥配伍而成(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院院內(nèi)制劑);肝素鈉注射液(12500U/2ml，2ml×10 支);20%甘露醇(250ml/瓶);注射用青霉素鈉(160 萬u/瓶);瓊脂糖(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 動(dòng)物分組

將30只雄性大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為模型組，對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組(即中風(fēng)1號(hào)加用甘露醇組)。測(cè)定大鼠腦組織NSE及S100 mRNA的變化。

2．2 造模

大鼠急性腦出血模型:根據(jù)參考文獻(xiàn)［1－7］制備大鼠腦出血模型，出血量經(jīng)過計(jì)算，約等同于人腦出血量10ml，20ml，30ml，40ml。

2．3 給藥

對(duì)照組:生理鹽水，1．5ml/次，灌胃 1次/日，腹腔注射1次/日。模型組:生理鹽水加甘露醇，1．5ml/次，灌胃1次/日，腹腔注射1次/日。實(shí)驗(yàn)組:中風(fēng)1號(hào)湯劑加甘露醇，1．5ml/次，灌胃1次/日，腹腔注射1次/日。以上動(dòng)物在造模術(shù)后，分別持續(xù)給藥3天。HE染色觀察大鼠腦組織出血后，血腫周圍組織形態(tài)。

用免疫組化法，測(cè)定大鼠腦組織中NSE、S100的表達(dá)。

2．4 石蠟切片微波修復(fù)抗原染色程序 1)烤干切片;2)熱修復(fù)抗原;3)自然冷卻后PBS(pH=7．0)洗滌3次，每次5min;4)在25℃ ～27℃下滅活內(nèi)源性酶;5)滅菌蒸餾水洗滌，PBS水洗，3次，每次5min;6)加5%BSA的封閉液，室溫下1h;7)5℃下，去掉余液體，加一抗;8)滴加生物素化鼠抗兔IgG;9)滴加試劑SABC;10)PBS重復(fù)洗3次;11)DAB顯色;12)于鏡下觀察，復(fù)染，分化，返藍(lán);13)脫水并封片處理。

TA克隆后通過PCR鑒定陽性克隆送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果結(jié)果經(jīng)過BLAST比對(duì)除去載體序列及與原MLAA-22重疊的部分后，在5'端延伸了424 bp。

2．5 圖像的分析及處理 光鏡下可見，陽性著色為神經(jīng)細(xì)胞的胞漿被染成黃色、棕黃色或棕褐色。顯微鏡采集視野圖片，用圖像分析儀觀察每張切片，同時(shí)測(cè)定腦組織中NSE和S100的值，每張切片均取5～6個(gè)視野，取其平均值。

2．6 大鼠腦組織中 NSE及 S100 mRNA的水平的測(cè)定

2．6．1 提取腦組織中總RNA1)取大鼠的腦組織(約250mg)，將腦組織研磨成粉狀(要在液氮中進(jìn)行)，將粉末快速轉(zhuǎn)移到 5．0ml的離心管內(nèi)，再加2.0ml Trizol，劇烈搖動(dòng)離心管。2)加200ml的氯仿/異戊醇(20∶1)，搖晃約 1 min使其混合均勻。3)15000rpm離心3min。4)將大約500ul的上清液轉(zhuǎn)移到2．0ml離心管中，加入100ul無水乙醇，混勻。5)將溶液全部轉(zhuǎn)移到2ml收集管內(nèi)(在GenClean柱中)，5min后離心。6)取出柱子后扔掉廢液，再將柱子放回管中，400ul RPE－Solution 13000rpm離心30s;于術(shù)后第3天，采集血清，測(cè)腦組織NSE及S100的濃度，稱重后戊巴比妥鈉麻醉，大鼠腦組織以針道為中心，前后各取腦片3mm，一片置于福爾馬林中固定，另一片置于液氮中冷凍。7)步驟6 重復(fù)1次。8)先將柱子取出來，收集管放回后離心，再次把柱子放進(jìn)離心管中。9)給內(nèi)膜中間加進(jìn)去 40ul的 DEPC－H2O，90℃，15000rpm下離心3min，可得到RNA樣品，即管內(nèi)的溶液。10)測(cè)OD值 (取260/280)，比值大于2．0的(包括2．0)，算出得到的RNA總的含量，取其中的10μg做逆轉(zhuǎn)錄。11)調(diào)節(jié)RNA濃度至10μg/μl。

RNA總的濃度=A260×50/2000×稀釋的倍數(shù)

2．6．2 RT(逆轉(zhuǎn)錄)反應(yīng)

逆轉(zhuǎn)錄總的反應(yīng)體積約20μl，每組均設(shè)有3個(gè)復(fù)管。在Eppendorf管中加3μl OligdT和2ul RNA，變性(75℃)，在置入冰中后，依次加入:dNTP 2μl，DEPC 水10ul，5 × Buffer 5μl、Rnasin 2．0μl、AMV 0．5ul。50℃反應(yīng)1．5h，將產(chǎn)物保存于零下20℃冰箱內(nèi)。

2．6．3 PCR(聚合酶鏈反應(yīng))

1)合成引物:據(jù)國際cDNA文庫檢索的原始序列，參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)受體引物序列。2)聚合酶鏈的反應(yīng):總的反應(yīng)體積為30μl，每組有3個(gè)復(fù)管。在PCR管中依次加:Buffer 5μl、dNTP 5μl、上游引物 1．5μl、下游引物1．5μl、cDNA 1．5μl、Taq 酶 2．0μl、無菌蒸餾水 20μl，加完后，把各個(gè)復(fù)管內(nèi)的液體混勻。放入PCR儀，80℃下變性，10min。3)凝膠電泳瓊脂糖:瓊脂糖2.0g，加到50ml的TAE中，加熱后搖勻，冷卻至60℃，灌膠。泳道的上樣量約為10μl的PCR產(chǎn)物，給其加5μl緩沖液，再電泳2．0h。觀察電泳結(jié)果，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)，算出NSE和S100 及GAPDH的比值(產(chǎn)物條帶面積×強(qiáng)度)。

2．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 17．0 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0．05 為有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間數(shù)據(jù)的比較用方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3．1 各組大鼠腦組織形態(tài)的觀察結(jié)果

正常NSE分布于神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿和突起中［6］，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)整齊，形態(tài)正常，NSE陽性細(xì)胞呈棕黃色。造模成功后可觀察到:細(xì)胞核呈深染的藍(lán)色，神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿內(nèi)廣泛分布著深染的棕黃色，呈顆粒樣的物質(zhì)，尤其在出血區(qū)周圍的細(xì)胞內(nèi)，顏色深，而且著色面積也較大。模型組與對(duì)照組比較，均存在顯著性差異(P＜0．05)，即在腦出血后，大鼠神經(jīng)元細(xì)胞胞漿和突起中的NSE就會(huì)從細(xì)胞內(nèi)釋出;實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，有顯著性差異(P＜0.05)，即用中風(fēng)1號(hào)湯劑可以有效地減少NSE的釋出。

正常S100 蛋白陽性的細(xì)胞為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞膜完整，陽性物質(zhì)均勻分布于胞核、胞漿和突起中，呈棕黃色［7］。實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到，造模成功的大鼠腦組織血腫周圍的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，陽性細(xì)胞的數(shù)量也有一定的增加，同時(shí)在細(xì)胞間質(zhì)中，也可見到陽性物質(zhì)，顏色不均勻，說明存在腦細(xì)胞的破壞，尤其是出血量為51ul、65ul水平的則更為明顯。模型組與對(duì)照組比較，有顯著性差異(P＜0．05);實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，具有顯著性差異(P＜0．05)，即藥物治療對(duì)于腦出血有明顯的改善作用。

3．2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織中NSE和S100 mRNA的含量測(cè)定

凝膠電泳大鼠腦組織S100 和GAPDH的擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶分別為272bp和490bp，掃描后半定量分析S100/GAPDH的吸光比值，研究得出:在急性腦出血后，造模大鼠的各個(gè)出血量水平S100 mRNA的表達(dá)和對(duì)照組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，即腦出血后S100 mRNA的表達(dá)增高，尤其是51ul、65ul水平S100 mRNA的表達(dá)升高最顯著，說明S100 mRNA也是監(jiān)測(cè)腦組織損傷特異、靈敏的指標(biāo);實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，有顯著性差異(P＜0．05)，即使用中西醫(yī)藥物聯(lián)合對(duì)于治療腦出血有明顯的改善作用。見表1～3。

表1 各組大鼠腦組織出血灶周圍NSE的表達(dá)(±s，n=10)

表1 各組大鼠腦組織出血灶周圍NSE的表達(dá)(±s，n=10)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0．05，＊＊P＜0．05;與模型組比較，△P ＜0.05。

對(duì)照組0．09 ±0．02 0．08 ±0．03 0．11 ±0．05 0．07 ±0．04模型組 151．15 ±7．53* 155．58 ±8．88* 160．24 ±6．92* 167．31 ±7．61*實(shí)驗(yàn)組 139．12 ±8．53＊＊△ 146．45±7．05＊＊△ 151．09±8．97＊＊△ 155．15 ±6．93＊＊△

表2 各組大鼠腦組織出血灶周圍S100 表達(dá)(±s，n=10)

表2 各組大鼠腦組織出血灶周圍S100 表達(dá)(±s，n=10)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0．05，＊＊P＜0．05;與模型組比較，△P ＜0．05。

對(duì)照組0．08 ±0．03 0．06 ±0．02 0．13 ±0．10 0．07 ±0．03模型組 149．77 ±15．86* 155．22 ±16．53* 162．36 ±12．57* 170．76 ±14．81*實(shí)驗(yàn)組 129．94 ±13．97＊＊△ 136．53 ±14．81＊＊△ 149．32 ±13．897 152．18 ±15．23＊＊△

表3 各組大鼠腦組織S100 表達(dá)(±s，n=10)

表3 各組大鼠腦組織S100 表達(dá)(±s，n=10)

注:與對(duì)照組相比，*P ＜0．05，＊＊P＜0．05;與模型組比較，△P ＜0．05。

對(duì)照組0．03 ±0．01 0．04 ±0．02 0．07 ±0．03 0．05 ±0．02模型組 24．17 ±2．53* 25．08 ±3．27* 30．65 ±2．31* 32．22 ±3．27*實(shí)驗(yàn)組 18．53 ±4．38＊＊△ 20．69±3．51＊＊△ 23．57±5．07＊＊△ 27．09 ±3．73＊＊△

本實(shí)驗(yàn)退火溫度從50℃ ～60℃，多次重復(fù)PCR循環(huán)過程，在各組的38ul、51ul水平上出現(xiàn)了相對(duì)清楚的目的基因條帶，25ul和38ul也出現(xiàn)了目的基因條帶，相對(duì)較彌散，初步考慮可能是因?yàn)镾100 mRNA在腦組織中表達(dá)相對(duì)弱。

4 討論

中風(fēng)1號(hào)是由黃芪，川芎和當(dāng)歸等中藥配伍而成，從中醫(yī)理論立法處方，具有祛瘀通絡(luò)，益氣活血，扶正固本的功效，可緩解急性期腦出血和改善神經(jīng)功能缺損的癥狀，有效改善患者預(yù)后，提高患者的生存質(zhì)量，是治療急性腦出血臨床驗(yàn)方。

實(shí)驗(yàn)中使用中風(fēng)1號(hào)干預(yù)后，明顯調(diào)節(jié)了NSE和S100 mRNA在腦組織中的表達(dá)，隨著出血量的增加其表達(dá)也逐漸增加，且NSE的變化比S100 更能直接的反映腦組織的損傷程度，同時(shí)從實(shí)驗(yàn)中也證明了中風(fēng)1號(hào)可明顯調(diào)控 NSE、S100的水平，保護(hù)損傷的腦組織。

從本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)大鼠的腦出血性損傷引起的神經(jīng)功能缺損及腦水腫，實(shí)驗(yàn)組可有效的改善愈后，在降低NSE和S100 mRNA的方面，明顯優(yōu)于模型組。其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。目前我們推測(cè)其可能是因?yàn)橹酗L(fēng)1號(hào)有效的改善了腦部的血流動(dòng)力學(xué)，使神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞膜相對(duì)穩(wěn)定，維持BBB正常的通透性，同時(shí)也減少組織液的滲出，減輕腦水腫，從而降低了NSE和S100 mRNA的釋放，具有保護(hù)腦神經(jīng)組織，改善患者預(yù)后的作用。本實(shí)驗(yàn)中的中西藥物聯(lián)合治療急性腦出血，吸取了中西藥各自的優(yōu)點(diǎn)，證實(shí)了臨床使用中風(fēng)1號(hào)治療急性腦出血是安全有效，為臨床開展中西醫(yī)結(jié)合治療急性腦出血提供了一定的參考。

［1］ Marc R，Yan H J，James Peeling．Experimental intracerebral hemorrhage in rat magnetic resonance imaging and histopathological correlates［J］．Stroke，1996，27(2):2312－2319．

［2］ Peeling J，Yan HJ，Chen SG，et al．Protective effects of free radical in hibitors inIntracere bral hemorrhage in rat［J］．Brain Res，1998，795(1－2):63－70．

［3］ Peeling J，Yan HJ，Chen SG，et al．Effect of FK－506 on inflammation and behav ioralhemorrhage in rat［J］．Exp Neurol，2001，167(2):341－347．

［4］ Altumbabic M，Peeling J，Del Bigil MR．Intracerebral hemorrhage in the rat:effects of hematoma aspiratrion［J］．Stroke，1998，29(9):197－192．

［5］ 呂田明，陸兵勛．大鼠尾狀核注射凝固自體動(dòng)脈血腦出血模型［J］．中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2006，23(1):88－90．

［6］ 鄒偉，王瓏，孫曉偉，等．頭針透刺對(duì)腦出血大鼠腦組織IL－6 表達(dá)影響的研究［J］．中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2012，40(1):81－83．

［7］ 鄒偉，王瓏，李丹，等．針刺“百會(huì)”透“曲鬢”對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血后灶周組織PAR－1 和NF－κBp65 表達(dá)的影響及其相關(guān)性分析［J］．中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(3):15－18．