針刺干預大鼠胰島素抵抗及下丘腦胰島素受體后IRS1 及其酪氨酸磷酸化的研究

何軍鋒，嚴潔，黃惠勇，王超，李江山，謝夢洲，屈婭婷

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

隨著人們生活水平的不斷提高，肥胖癥的發病率日益增高，其并發癥，如糖尿病、心血管疾病、癌癥等已成為嚴重影響人類健康的世界性醫學難題［1］。由于利用高脂飲食建立動物模型(DIO)與人類肥胖的自然過程相近，進而成為研究肥胖癥的重要方法之一。針灸減肥具有簡便有效，且無不良反應等優點［2］，因而備受關注。本研究擬觀察針刺足陽明經穴對DIO大鼠胰島素抵抗及下丘腦胰島素受體后IRS1的影響。

1 材料和方法

1．1 模型建立

SD雄鼠(購于湖南中醫藥大學)，體質量50～70g。適應性喂養1周，隨機分組:正常對照組(A組)10只，給予普通飼料(由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供);實驗組60只，給予高脂飼料［3］(由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供)。自由進食飲水，室溫21～24℃。每2周稱重并記錄，進行體重(BW)分析。大鼠肥胖判斷標準:凡經高脂飼料喂養12周后，SD大鼠的BW超過普通飼料喂養大鼠BW的20%作為實驗肥胖大鼠。

1．2 動物分組及干預

SD肥胖大鼠模型建立后，取30只肥胖大鼠，隨機分為肥胖模型組(模型組)、肥胖模型+針刺足陽明經穴(針刺組)、針刺非經穴組(非經穴組)，每組10只。針刺組將清醒大鼠固定于特制的裝置，取單側四白、天樞、足三里、內庭穴(隔天交替針另一側)，局部75%酒精常規消毒后，針入3～5mm，接通電針儀，頻率為10Hz，強度3mA，以胡須及肢體微動為度，時間15min，每天治療1次，治療6天休息1天，持續4周。穴位的定位參照《實驗針灸學》常用實驗動物針灸穴位。針刺非經穴組在固定大鼠后選擇四白、天樞、足三里、內庭穴旁開非經穴點針刺;正常組、模型組則行抓取固定，不作任何治療，持續4周。

1．3 指標檢測

1．3．1 血清生化指標檢測 大鼠取血前需過夜禁食8h，準確測量體質量(BW)，內眥靜脈采血，使用強生牌穩豪血糖儀測定空腹血糖(FPG)，離心分離血清，－80℃保存。放免法測定FINS水平。HOMA－指數(HOMA－index):(FINS×FPG)/22．5。

1．3．2 蛋白檢測 采用Western blot法［4］。－70℃冰箱里取出大鼠下丘腦組織，用細胞裂解液裂解，進行超聲萃取后測定總蛋白濃度。分裝后置于－20℃冰箱保持。SDS－PAGE分離蛋白，轉置PVDF膜(Pierce產品)。5%的牛奶TBS－T封閉PVDF膜后，予Upstate公司的IRS1 及IRS1 抗磷酸酪氨酸抗體結合膜蛋白，4度搖床過夜;TBS－T洗膜后加HRP二抗，洗膜3次;PVDF膜予ECL法顯色后，X－膠片曝光，以 β－actin為對照，置于光密度儀下檢測IRS1 及酪氨酸磷酸化的相對含量。

1．4 統計處理 用SPSS 13．0 統計軟件處理，所有數據用均數±標準差表示，多組均數比較用方差分析。

2 結果

2．1 體質量變化 高脂飲食喂養12周后，模型組大鼠體質量達(524．32±34．18)g，顯著高于空白組與針刺組(P ＜0．05 或 P＜0．01)，但與非經穴組比較，無顯著差異。針刺足陽明經穴組能顯著抑制高脂模型大鼠體質量，與非經穴組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量變化比較(±s，n=10)

表1 各組大鼠體質量變化比較(±s，n=10)

注:與空白組比較，*P ＜0．05;與模型組比較，●P ＜0．05，●●P ＜0.01;與非經穴組比較，○P ＜0．05。

空白組 56．12 ±5．18 467．12 ±28．15●●○模型組 58．64 ±6．85 524．32 ±34．18*針刺組 59．22 ±7．25 480．23 ±30．75＊●○非經穴組 55．46 ±4．25 512．45 ±35．25*

2．2 干預后各生化指標比較 與空白組比較，模型組及非經穴組空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、HOMA－指數(HOMA－INDEX)均顯著升高(P＜0．01)。針刺組大鼠FPG、FINS、HOMA－INDEX均顯著下降，與模型組及非經穴組比較，差異具有統計學意義(P＜0．01)。見表2。

空白組 4．56±0．97●○ 8．55±3．45●○ 1．88±1．22●○模型組 7．65 ±1．05* 15．43 ±3．28* 5．15 ±1．31*針刺組 5．22±0．86●○ 8．38±3．57●○ 2．16±1．19●○非經穴組 7．26 ±0．77* 13．89 ±2．25* 4．85 ±1．45*

2．3 各組IRS－1 蛋白及其酪氨酸磷酸化水平

IRS－1 蛋白表達由低到高依次為模型組、非經穴組、針刺組、空白組;各組組間比較，并無顯著性差異(P＞0．05)。肥胖模型組及非經穴組IRS－1 酪氨酸磷酸化水平較低，空白組和針刺組均顯著高于模型組和非經穴組(P＜0．01)，提示針刺足陽明經穴可顯著改善肥胖模型的IRS－1 酪氨酸磷酸化水平。見表3。

表3 IRS－1 蛋白及其酪氨酸磷酸化比較(±s，n=10)

表3 IRS－1 蛋白及其酪氨酸磷酸化比較(±s，n=10)

注:與空白組比較，*P ＜0．01;與模型組比較，●P ＜0．01;與非經穴組比較，○P ＜0．01。

空白組 94．12 ±9．18 132．22 ±11．24●○模型組 85．44 ±8．85 110．23 ±12．65*針刺組 90．282 ±10．25 128．64 ±12．45●○非經穴組 87．45 ±7．89 114．14 ±11．98*

3 討論

以高脂飼料喂養大鼠是建立飲食誘導肥胖模型最常用的方法，這與人類肥胖發生的特點相似［5］。肥胖患者內分泌代謝紊亂，普遍存在著高胰島素血癥，提示機體胰島素敏感性下降，存在嚴重的胰島素抵抗。胰島素經血液循環到達靶組織，并與其上的胰島素受體α亞單位結合，激活胰島素受體β亞單位從而發生自磷酸化。被激活的胰島素受體β亞單位進一步磷酸化細胞內信號分子IRS－1，后者被磷酸化后表現出一種特異性結合位點，能募集并激活下游含有SH2 區域的蛋白質，使得信號以激酶鏈式反應下傳。IRS－1 作為胰島素受體信號轉導起始的一個重要信號分子，其蛋白表達及酪氨酸磷酸化程度的降低可引起胰島素生物效應的減弱，最終引起胰島素抵抗［6］。

中醫學認為，足陽明胃經在能量代謝中起著樞紐作用。在針刺減肥的研究中，足陽明胃經的穴位天樞、足三里、內庭是最常用的腧穴［7］。蔡氏［8］的研究表明，針刺足三里、內庭和胰俞，可顯著上調2型糖尿病大鼠肝組織IRS1 mRNA表達。我們前期研究表明，足陽明經的四白穴與胃腸運動密切相關且兩者傳入信息可以在中樞匯聚［9－10］，它可能在肥胖研究中有著重要的作用。因此，本研究中選擇足陽明經穴這四個腧穴作為研究對象。針刺足陽明經穴的結果表明，這四個腧穴可顯著抑制高脂飲食誘導的肥胖，同時可較好地改善肥胖模型的胰島素抵抗狀態。此外，讓人感興趣的是，針刺足陽明經四白、天樞、足三里和內庭，盡管對于IRS－1 蛋白表達并無顯著的提高，卻可顯著提高IRS－1 酪氨酸磷酸化水平，這與葉氏用中藥干預的結果頗為類似［11］，這意味著針刺可改善受體后信號傳導通路中的磷酸化水平，值得進一步研究。

［1］ He JF，Wong SS，Qu YT，et al．Obesity－Related Mechanism of Food Intake Suppression［J］．Journal of Brain Science，2011，36:61－80．

［2］ 趙強，馮偉．針刺治療單純性肥胖取穴規律的臨床研究［J］．天津中醫藥大學學報，2011，30(2):95－97．

［3］ 孫志，張中成，劉志城．營養性肥胖動物模型的實驗研究［J］．中國藥理學通報，2002，18(4):466－467．

［4］ 劉向陽，都健，王惠敏，等．胰島素抵抗大鼠肝臟絲氨酸/酪氨酸磷酸化IRS－1 表達異常與脂聯素相關的研究［J］．中國醫科大學學報，2009，38(4):250－252．

［5］ Moraes JC，Coope A，Morari J，et al．High－Fat Diet Induces Apoptosis of Hypothalamic Neurons［J］．PLOS ONE，2009，4(4):5045．

［6］ Van Eijk M，Aten J，Bijl N，et al．Reducing Glycosphingolipid Content in Adipose Tissue of Obese Mice Restores Insulin Sensitivity，Adipogenesis and Reduces Inflammation［J］．PLOS ONE，2009，4(3):4723．

［7］ 趙強，馮偉．針灸治療單純性肥胖取穴規律的臨床研究［J］．天津中醫藥大學學報，2011，30(2):95－97．

［8］ 蔡輝，袁愛紅，魏群利，等．針刺對2型糖尿病大鼠肝組織IRS1 和2 基因表達的調整［J］．中華中醫藥學刊，2009，27(6):1140－1142．

［9］ 何軍鋒，嚴潔，劉健華，等．胃擴張和針刺大鼠四白傳入信息對孤束核神經元放電整合的影響［J］．中華神經醫學雜志，2005，4(4):330－333．

［10］ He Junfeng，Yan Jie，Chang Xiaorong，et al．Neurons in the NTS of rat response to gastric distention stimulation and acupuncture at body surface points［J］．The American Journal of Chinese Medicine，2006，34(3):427－433．

［11］ 葉愛麗，陸付耳，徐麗君，等．黃連解毒湯對胰島素抵抗大鼠骨骼肌IRS－1 表達及酪氨酸磷酸化水平的影響［J］．中醫雜志，2005，16(9):695－697．