電針百會、風(fēng)府穴對學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠Bcl－2/Bax基因表達(dá)的影響

張迪，鄧俏，孫陽

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

癡呆是一種以多種高級皮層神經(jīng)元紊亂所致的智能衰退為主要特征，以記憶、理解、計(jì)算、學(xué)習(xí)等能力以及判斷力的障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。病理表現(xiàn)主要為腦萎縮，而腦萎縮又是由神經(jīng)細(xì)胞凋亡及壞死所引起的，因此在凋亡前期對細(xì)胞凋亡啟動環(huán)節(jié)的遏制能明顯的挽救即將萎縮的腦神經(jīng)元，逆轉(zhuǎn)凋亡的命運(yùn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Bcl－2 家族蛋白在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［1－2］，根據(jù)其功能可分為兩類:一類是以Bcl－2、Bcl－xL為主要代表的抗凋亡蛋白;另一類是促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bak 等［3］。早在 1993 年 Korsmeyer［4］就發(fā)現(xiàn)這兩種功能的Bcl－2 成員的比例決定著細(xì)胞是否走向凋亡，尤其是Bcl－2 和Bax兩者的比值。Bcl－2 作為抗凋亡基因可抑制許多因素所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而Bax是促凋亡基因，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程［5］。若腦內(nèi)Bcl－2 基因釋放增加，Bax基因釋放減少，可減少腦內(nèi)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶能力，而當(dāng)比例相反時(shí)則加速細(xì)胞的凋亡。本研究采用D－半乳糖腹腔注射合并腦內(nèi)雙側(cè)Meynert鵝膏草氨酸注射的方法制做復(fù)合型學(xué)習(xí)障礙模型，運(yùn)用電針百會、風(fēng)府穴的方法進(jìn)行治療，觀察該方法對學(xué)習(xí)記憶障礙大鼠腦內(nèi)Bcl－2 家族基因釋放的影響，探討其改善學(xué)習(xí)記憶障礙的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 選取健康Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量(470±50)g，18～22月齡48只，隨即分成4組，分別為假手術(shù)組、模型組、西藥組、電針組，每組12只。

1．2 模型制作與治療方法 模型組、西藥組、電針組均先腹腔注射以生理鹽水配置的0．96%D－半乳糖6周，然后行腦內(nèi)雙側(cè) Meynert鵝膏草氨酸(Ibotenic acid，IBO)注射。假手術(shù)組腹腔注射及腦內(nèi)注射藥物均以同劑量生理鹽水替代。西藥組灌胃給予都可喜片3．6mg/kg/d，連續(xù)4周。電針組取百會、風(fēng)府，用30號0．5 寸不銹鋼毫針針刺，施以連續(xù)波，頻率150Hz治療，留針15min，連續(xù)治療4周。

1．3 主要儀器試劑 KWD－808Ⅱ全能脈沖電療儀(江蘇長城醫(yī)療器械有限公司);Bcl－2 原位雜交檢測試劑盒及Bax原位雜交檢測試劑盒。

2 結(jié)果

見表1、表2。

表1 各組大鼠Bcl－2 mRNA檢測結(jié)果

表2 各組大鼠Bax mRNA檢測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠腦內(nèi)Bcl－2基因較假手術(shù)組陽性百分率略微增強(qiáng)，而Bax基因陽性表達(dá)則顯著增強(qiáng);西藥組藥物及針刺組治療后大鼠腦內(nèi)Bcl－2基因較假手術(shù)組陽性百分率明顯增強(qiáng)，而Bax基因陽性表達(dá)則無顯著變化;西藥組與針刺組比較，無顯著性差異。

3 討論

細(xì)胞凋亡(apoptosis)最早是1972年由Kerr教授等三位科學(xué)家首先提出的一種不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞死亡程序［6］。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素刺激后，便遵循自身的規(guī)律，通過啟動內(nèi)部轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制激活凋亡基因，繼而在基因調(diào)控下一步步自動走向死亡，其中Bcl－2家族是最主要的凋亡調(diào)控基因之一［7－8］。Bcl－2是從惡性生長的人濾泡B細(xì)胞中分離到的一種原癌基因，但Bcl－2本身并不能引起細(xì)胞惡變，而是作為細(xì)胞凋亡的一個(gè)潛在抑制劑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡在機(jī)體內(nèi)存在三種途徑［9］，但決定細(xì)胞是否凋亡的最直接環(huán)節(jié)為Bax和Bcl－2形成同源還是異源二聚體:1)如果Bcl－2和Bax的表達(dá)量幾乎相同，所形成的Bcl－2/Bax異源二聚體占優(yōu)勢，則細(xì)胞的存活期正常;2)如果Bcl－2較Bax表達(dá)相應(yīng)增多，所形成的Bcl－2/Bcl－2同二聚體占優(yōu)勢將延長細(xì)胞的存活期;3)如果Bax較Bcl－2表達(dá)增多，使得Bax/Bax同二聚體占優(yōu)勢，則發(fā)生細(xì)胞凋亡［10］。Bcl－2家族蛋白基因中的抗凋亡蛋白基因成員和促凋亡蛋白基因成員之間的協(xié)同作用決定著機(jī)體內(nèi)細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序。大量的研究表明，機(jī)體內(nèi)部存在三種細(xì)胞凋亡途徑:線粒體途徑、死亡受體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。其中Bcl－2 蛋白基因不僅可通過干擾死亡受體途徑進(jìn)入細(xì)胞凋亡的線粒體依賴途徑;而且存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Bcl－2蛋白基因還可通過降低鈣離子的釋放來抑制細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡。這三條通路是相互作用的，細(xì)胞的命運(yùn)就是它們互相作用的結(jié)果［9］。

細(xì)胞凋亡時(shí)刻存在于各種機(jī)體生命進(jìn)程中，其中癡呆進(jìn)展過程中存在大量的細(xì)胞凋亡程序。老年癡呆歸屬于中醫(yī)學(xué)中“呆證”、“善忘”、“狂證”、“郁證”等證范疇，腎虛髓虧為其病根，痰濁內(nèi)生為其標(biāo)，癡呆病位在腦，督脈是奇經(jīng)八脈之一，是人體諸陽之總匯，督脈入屬于腦，又為陽脈之海，主一身之陽，陽氣旺盛可促進(jìn)痰祛瘀化。而督脈百會穴位居巔頂部，其深處即為腦之所在。楊上善注說“胃流津液滲入骨空，變而為髓，頭中最多，故為海也。是腎所生，其氣上輸腦蓋百會穴，下輸風(fēng)府也”。本實(shí)驗(yàn)選取百會、風(fēng)府作為針刺穴位，并施以電針，當(dāng)這種脈沖電流作用于機(jī)體時(shí)，會使得體內(nèi)離子濃度和分布發(fā)生顯著變化，從而影響機(jī)體組織功能。低頻脈沖電流通過毫針刺激腧穴，具有調(diào)整機(jī)體功能，促進(jìn)氣血循環(huán)等作用。電針刺激百會、風(fēng)府或許可抑制鈣離子的釋放進(jìn)而影響凋亡途徑中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路及線粒體通路，進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡程序的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)以神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl－2 做為檢測指標(biāo)，觀察電針對記憶障礙型大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。在對細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl－2/Bax的觀察中發(fā)現(xiàn)，針刺組模型大鼠皮層及海馬區(qū)內(nèi)Bcl－2 蛋白基因陽性表達(dá)增強(qiáng)，而Bax蛋白基因則無顯著變化，提示針刺百會、風(fēng)府穴可以通過促進(jìn)腦內(nèi)Bcl－2 蛋白基因的高表達(dá)抑制皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而對神經(jīng)元起到保護(hù)作用，延長神經(jīng)元的壽命，對學(xué)習(xí)記憶功能發(fā)揮有益的作用。

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