頭穴叢刺結(jié)合環(huán)境刺激對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后學(xué)習(xí)記憶能力影響的實(shí)驗(yàn)研究

劉波，鄒偉，孔妍

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是指在圍產(chǎn)期窒息缺氧等因素導(dǎo)致的腦部缺氧缺血性損害，是兒童致殘的主要原因，給家庭和社會(huì)造成極大負(fù)擔(dān)。本實(shí)驗(yàn)采用7日齡新生大鼠制備HIBD模型，給予頭穴叢刺及環(huán)境刺激干預(yù)，觀察HIBD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。探討頭穴叢刺結(jié)合環(huán)境刺激治療缺氧缺血性腦病患兒的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

7日齡Wistar大鼠80只(由上海斯萊克公司提供)，雌雄不限，體質(zhì)量均在11～15g之間。隨機(jī)分為假手術(shù)組(A)、造模組(B)、頭穴叢刺組(C)、環(huán)境刺激組(D)、頭穴叢刺加環(huán)境刺激組(E)。每組大鼠隨機(jī)分為14天組、21天組，每組8只。

1.2 模型制作

按照Rice法建立HIBD動(dòng)物模型。7日齡新生Wistar大鼠［1］，吸入適量無水乙醚麻醉，暴露頸部。局部碘伏消毒，做頸部正中切口，無菌分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，并用外科6－0 滅菌手術(shù)絲線行雙線結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合傷口。手術(shù)結(jié)束后，將動(dòng)物放回原飼養(yǎng)環(huán)境中恢復(fù)120min后，置于自制的有機(jī)玻璃缺氧箱中(保持37℃水浴恒溫)，持續(xù)將體積濃度為8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w以氣流量為0.5l/min的速度輸入缺氧箱中。術(shù)后出現(xiàn)平衡異常、不能翻身或夾尾左旋者視為造模成功，將其納入實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，而不結(jié)扎，也不予以缺氧處理。

1.3 頭穴叢刺和環(huán)境刺激

假手術(shù)組大鼠術(shù)后置于普通母鼠籠中飼養(yǎng)，不予任何治療。造模組術(shù)后另置普通母鼠籠中飼養(yǎng)，不予任何治療。頭穴叢刺組大鼠采用叢刺法，按照“大鼠穴位圖譜”［2］所示，取百會(huì)穴及百會(huì)左、右側(cè)各旁開1mm處針刺。每穴快速捻轉(zhuǎn)1min后留針120min，每日1次。環(huán)境刺激組每日將幼鼠與母鼠分離放入EE籠［3］內(nèi)，給予EE干預(yù)120min。播放舒緩的輕音樂，并以明暗紅色燈光照射。頭穴叢刺加環(huán)境刺激組予以頭穴叢刺后再將幼鼠放入EE籠中給予環(huán)境刺激120min，拔針放回母鼠籠中。

1.4 Morris水迷宮測(cè)試，

Morris水迷宮由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)針灸實(shí)驗(yàn)室提供。水迷宮為一直徑150cm、高50cm的圓形不銹鋼水池。在其上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，及計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)可自動(dòng)跟蹤計(jì)時(shí)并同步記錄大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。用加熱器使水溫控制在(24±2)℃。在水池邊緣標(biāo)注東、南、西、北四個(gè)入水點(diǎn)，等分為四個(gè)象限，并于水池象限中間設(shè)立一個(gè)直徑9cm、高29cm的透明有機(jī)玻璃平臺(tái)，使平臺(tái)頂?shù)陀谒嫦?cm處。測(cè)試時(shí)保持光線一致、室內(nèi)安靜。

1.4.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

用于檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。連續(xù)訓(xùn)練5天，每天訓(xùn)練4次。每天將大鼠面向池壁隨機(jī)從4個(gè)象限中選取一個(gè)不重復(fù)的入水點(diǎn)放入水中，每次訓(xùn)練間隔時(shí)間為30s，記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間為逃避潛伏期。如大鼠在1min內(nèi)未找到平臺(tái)，則以60s計(jì)算。各組大鼠以最后1天4次所用時(shí)間的總平均值作為觀察指標(biāo)。

1.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

用于測(cè)量大鼠記憶保持能力。在第5天定位航行實(shí)驗(yàn)后撤除平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，觀察其60s內(nèi)穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)，測(cè)量4次取其平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。逃避潛伏期比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析;空間搜索實(shí)驗(yàn)中穿越目標(biāo)次數(shù)及遠(yuǎn)期記憶潛伏期采用單因素方差分析，均數(shù)間的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 或P＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)A組與B組比較，有顯著性差異(P＜0.01)，14天和21天后各治療組C、D、E組與B組比較，有顯著性差異(P＜0.01)。各組間評(píng)分比較見表1、圖1。

2.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 各組間評(píng)分比較見表2，圖2。

圖1 定位航行實(shí)驗(yàn)游泳軌跡圖

圖2 空間探索實(shí)驗(yàn)游泳軌跡

表1 逃避潛伏期(±s，s)

表1 逃避潛伏期(±s，s)

注:與 A組比較，＊＊P＜0.01;與 B 組比較，#P ＜0．05，##P ＜0.01;與 C組、D組比較，＆＆P ＜0.01。

A 15.42±5.26 12.16±5.49 B 8856.34±6.38＊＊ 48.12±4.36＊＊C 831.16±8.06## 25.69±4.25##D 28.35±4.69## 25.48±7.34##E 8 118.35 ±4.69##＆＆ 14.31 ±4.288##＆＆

表2 穿臺(tái)次數(shù)(±s)

表2 穿臺(tái)次數(shù)(±s)

注:與A組比較，＊＊P＜0.01;與 B組比較，##P＜0.01;與 C組、D組比較，＆＆P ＜0.01。

A 4.65±1.54 6.7±1.28 B 883.4±1.21* 3.1±1.65＊＊C 84.2±1.35# 4.7±1.52#D 4.1±1.05# 4.5±1.14#E 85.9 ±1.05##＆＆ 6.0 ±1.548##＆＆

3 討論

學(xué)習(xí)記憶是腦的高級(jí)功能，而學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位在海馬。海馬在情緒整合、認(rèn)知和記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)中作用重大。海馬結(jié)構(gòu)的可塑性是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)。海馬CA1 區(qū)損傷后必將引起腦發(fā)育過程中功能和行為的異常［4］。

MorriS水迷宮是由MorriS發(fā)明并用于動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶研究［5］。Arteni［6］采用雙平臺(tái)的水迷宮，通過輪流升起其中一個(gè)平臺(tái)進(jìn)行測(cè)量動(dòng)物工作記憶的能力。而Markwoska［7］在空間探索實(shí)驗(yàn)階段中發(fā)現(xiàn)，假使能夠?qū)⑵脚_(tái)間歇性的出現(xiàn)，可以更加敏感的測(cè)量動(dòng)物的空間記憶能力。目前MorriS水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)軌跡運(yùn)用專業(yè)軟件進(jìn)行分析，并對(duì)動(dòng)物的行為進(jìn)行實(shí)時(shí)攝像記錄。MorriS水迷宮可作為記憶量化的良好指標(biāo)反映動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的形成和維持時(shí)間。

頭穴叢刺是針灸專家于致順教授在大量的臨床經(jīng)驗(yàn)和科研工作的基礎(chǔ)上對(duì)頭穴針刺系列研究的總結(jié)與深化。頭穴叢刺法便于與康復(fù)技術(shù)結(jié)合，不同環(huán)境刺激，可以使腦的形態(tài)和功能產(chǎn)生不同的變化，而豐富環(huán)境刺激能夠促進(jìn)腦發(fā)育和各種腦損傷的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用頭穴叢刺結(jié)合豐富環(huán)境刺激干預(yù)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14天、21天造模組與假手術(shù)組相比較逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，原平臺(tái)象限游泳距離減少。但給予頭穴叢刺和環(huán)境刺激后，缺氧缺血性腦損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善。結(jié)果表明，盡管圍生期缺氧缺血可以造成大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降，如果早期干預(yù)給予頭穴叢刺和環(huán)境刺激，可以明顯改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，甚至可能使學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)到正常水平。

綜上所述，缺氧缺血可造成學(xué)習(xí)記憶能力受到損傷，頭穴叢刺結(jié)合環(huán)境刺激法能夠促進(jìn)腦損傷大鼠缺氧缺血后學(xué)習(xí)記憶能力的提高，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

［1］ 劉波，唐強(qiáng)，邢艷麗，等．頭穴叢刺結(jié)合環(huán)境刺激對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬微管相關(guān)蛋白－2 和p38 表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］．針灸臨床雜志，2011，27(2):63－66．

［2］ 華興邦，周浩良．大鼠穴位圖譜的研制［J］．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，1991(1):1－5．

［3］ Rosenberg AA，Muydaugh E．The effect of blood glucogse consentration on postasphyxia cerebal hemodynamics in newborn lambs［J］．Pediatr Res，1990，27:454．

［4］ 孔妍，唐強(qiáng)，朱路文，等．缺氧缺血性腦損傷后針康法對(duì)幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬微管相關(guān)蛋白－2 表達(dá)的影響［J］．中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2011，17(4):310－312．

［5］ Morris R．Spatial locaalization does not require the presence of localcues［J］．Learning and Motviation，1981，12:239－260．

［6］ Arteni NS，Salgueiro J．Neonatal cerebral hypoxia ischemia causes lateralized memory impairments in the adult rat［J］．Brain Research，2003，973(2):171－178．

［7］ Markwoska AL，Spangler EL．Behavioral assessment of the senescence accelerated moues(SAM P8 and Rl)［J］．Physiol Behav，1998，64:15－26．