細節對高效液相色譜法檢測結果準確性的探討

花素靜，楊 銘，梁 軍

(1.鄭州市獸藥飼料監察所，河南 鄭州 450002; 2.商丘職業技術學院 生物工程系，河南 商丘 476000)

高效液相色譜法(high performance liquid chromatographu,HPLC)又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等.高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析.該方法已成為化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術[1]36-38.

高效液相色譜法具有分離效果好、靈敏度高、應用范圍廣、分析速度快等優點.在進樣量為μL數量級的情況下，常規紫外檢測器的靈敏度可達0.01ng，并可以分析70%以上的有機化合物.大多數樣品在30 min內可完成分析，甚至有些樣品在5min內即可完成分析.此外，高效液相色譜法還具有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點.但進行高效液相色譜分析時，從樣品處理到上機，每一個細節都要處理得當，否則，就會造成分析結果相對偏差較大.依據行業標準，含量測定的對照溶液和樣品供試溶液每份至少注樣2次，由全部結果(n>=4)求得平均值，相對標準偏差(RSD)一般應不大于1.5%[2]3. 本文以注射用青霉素鉀為試驗樣品，操作嚴格依據2010年版《中華人民共和國獸藥典》一部標準[3]3，通過兩臺高效液相色譜儀間的比對試驗，詳細分析說明該問題.

1 材料和方法

1.1 儀器

BP211d十萬分之一天平，北京塞多利斯天平有限公司.

1100高效液相色譜儀/VWD檢測器，安捷倫科技有限公司，配Aglient HC-C18(2)柱.

1200高效液相色譜儀/VWD檢測器，安捷倫科技有限公司，配Eclipse XDB-C18柱.

1.2 試劑

青霉素對照品(K0251206，92.7%，中國獸醫藥品監察所)；注射用青霉素鉀(2.5 g∶400萬單位)；乙腈(HPLC級)；無水磷酸二氫鉀(優級純)；超純水.

1.3 檢驗方法

1.3.1 色譜條件

流動相：0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液∶乙腈(70∶30，用磷酸調pH至2.5)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：225 nm；柱溫：26 ℃.

1.3.2 處理步驟

1.3.2.1 溶液配制

標準品溶液：精密稱取青霉素對照品0.05 g兩份分別至100 mL容量瓶，各加少許超純水，輕搖使標準品充分溶解，繼續加入高純水至刻度線附近，用一次性滴管定容至刻度，上下振搖量瓶使充分混勻，得兩份終濃度為0.5 mg/mL的標準溶液.

樣品溶液：精密稱取注射用青霉素鉀樣品0.05 g兩份分別至100 mL容量瓶，各加少許超純水，輕搖使標準品充分溶解，繼續加入高純水至刻度線附近，用一次性滴管定容至刻度，上下振搖量瓶使充分混勻，得兩份終濃度為0.5 mg/mL的樣品溶液.

1.3.2.2 過濾與上機

標準品溶液：取規格為1 mL的一次性注射器，從一份標準品溶液中吸取1 mL，直接分別注入兩個樣品瓶中，每個樣品瓶中約0.5 mL溶液，擰緊瓶蓋，將兩瓶標準品溶液分別在兩臺高效液相色譜儀上按照色譜條件進行檢測，另一份標準品溶液同上分別注入兩個樣品瓶中，分別在兩臺高效液相色譜儀上按照色譜條件進行檢測.

樣品溶液：取規格為1 mL的一次性注射器，從一份樣品溶液中吸取1mL，通過一個針筒式濾膜過濾器，連續分別過濾至兩個樣品瓶中，每個樣品瓶中約0.5 mL溶液，擰緊瓶蓋，將兩瓶樣品溶液分別在兩臺高效液相色譜儀上按照色譜條件進行檢測，另一份樣品溶液同上分別注入兩個樣品瓶中，分別在兩臺高效液相色譜儀上按照色譜條件進行檢測.

2 結果

測試結果如圖1、2.

圖1 Aglient 1100圖譜

圖2 Aglient 1200圖譜

依據兩臺高效液相色譜儀顯示主要參數結果計算檢測樣品含量，按外標法以峰面積計算，公式如下:

A——試樣溶液對應的色譜峰面積響應值；Ms——標準品質量(g)；

Cs——青霉素標準品的純度(%)；D——試樣稀釋倍數；

As——青霉素標準溶液對應的色譜峰面積響應值；M——試樣質量(g)；

Ds——青霉素標準品稀釋倍數；平均裝量——經檢測，其值為2.5077 g.

每臺儀器檢測含量結果取兩樣平均值，結果如表1所示.

表1 兩臺高效液相色譜儀檢測參數及計算含量結果

通過檢測結果及計算發現兩臺儀器的檢測結果相對偏差較大(為1.8%).

3 原因分析

3.1 青霉素標準品及樣品分解因素

藥物中青霉素檢測的處理方法簡單，故開始便在青霉素標準品及樣品分解上找原因.一直認為青霉素標準品及樣品易分解，如在配制時間不一致、不同時間進樣，可能會因標準品及樣品的分解程度不一而導致檢測結果相對偏差過大.后通過同時配制標準品、同時配制樣品、同時進樣，并將其中1瓶標準品在4個小時內進樣6次，發現青霉素基本未分解，結果比第一次略好一些，但是差別非常小，通過檢測結果分析發現相對偏差仍然較大(為1.6%)，相關圖譜及數據見圖3及表2所示，故而排除青霉素分解的因素.

圖3 同一瓶對照品四個小時內所有圖譜的疊加圖譜

3.2 儀器間的影響

排除青霉素標準品及樣品分解因素影響后，我們懷疑儀器間的相對偏差.但通過將一臺儀器上的同一瓶標準品、同一瓶樣品在另一臺儀器上進樣，計算結果顯示，相對偏差在可控范圍內(0.11%)，說明并不是儀器的原因,方法如上述外標法計算，具體數值如下表3所示.

表2 同一瓶對照品四個小時內峰面積響應值

表3 兩臺高效液相色譜儀檢測參數及計算含量結果

3.3 一次性注射器及一次性濾膜過濾器吸附效應的影響

在排除青霉素標準品及樣品分解因素、儀器間的影響因素后，我們開始在樣品處理步驟上找原因.思前慮后，比較所有樣品瓶間的處理，我們認定整個樣品處理過程只是在過濾環節有所不同，具體來說就是我們用注射器及濾膜過濾的樣品先裝一進樣瓶后，又用同一注射器及同一濾膜過濾再次過濾樣品分裝于另一進樣瓶.通過查閱相關資料得知，一方面因為本實驗使用的一次性注射器及濾膜過濾器，其材質為塑料及有機系尼龍，吸附能力非常強，吸附了溶液中的溶質，另一方面相當于第一次過濾時注射器及濾膜沒浸潤，而第二次過濾時相當于已浸潤.因此，即使用同一注射器及同一濾膜過濾同一樣品時，其吸附及浸潤(稀釋)因素對結果可能影響很大.

4 改進措施

針對上述可能導致結果相對偏差過大因素，重新稱量青霉素對照品與樣品，重新同時溶解、定容對照品與樣品溶液，用1mL一次性注射器吸取溶液，通過一個一次性濾膜裝入一個樣品瓶中后，換注射器與濾膜，繼續裝瓶，每個樣品瓶中的溶液體積約為1mL.同時在兩臺高效液相色譜儀上進行檢測.

5 改進后結果

經過改進后，兩臺高效液相色譜儀檢測到的含量相對偏差在可控范圍內(0.13%)，結果如表4所示，有明顯改善.

表4 兩臺高效液相色譜儀檢測參數及計算含量結果

6 結論

第一，由于青霉素水溶液的半衰期短，因此在做青霉素類藥物檢測時，對照品溶液及樣品溶液最好現配現用、同步進行處理，才可以從根本上保證檢測結果的準確性.

第二，對于高效液相色譜的紫外檢測器，其氘燈能量與使用時間有很大關系，如果氘燈使用時間超出使用壽命，其能量可能不足，從而對檢測結果的正確性帶來不確定因素.

第三，樣品處理過程中的細節問題必須考慮.本文出現的問題，其實是很小的細節問題，但其對檢測結果的影響卻是很大的.一次性注射器及尼龍針筒式濾膜過濾器，適用范圍廣，可應用于絕大多數有機溶液及無機溶液的過濾.由于塑料及尼龍濾膜對溶質的吸附(稀釋)作用現在還沒有較全面的資料介紹，故而在日常的含量檢測中，必須取相同體積的標準品溶液與樣品溶液通過濾膜過濾器.本文試驗證明，就是這個貌似不起眼的細節，大大影響了檢驗數據的真實性與準確性.

[1] 高效液相色譜法[J].北方園藝,2012(21).

[2] 獸藥檢驗操作規程[S].中國獸醫藥品監察所,2005.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國獸藥典(一部)[M].北京：中國農業出版社,2011.