HPLC 法測定不同產地魚腥草中不同部位蘆丁的含量

李瑞玲 ，崔運啟，劉奇森

黃淮學院化學化工系，駐馬店463000

魚腥草為三白草棵蕺菜屬植物的全草，具有清熱解毒、利尿消腫、止血等功效［1］，傳統中醫上主要應用于腫痛吐膿、痰熱喘咳、熱痢熱淋、癰腫瘡毒等癥的治療［2］。現代藥理研究表明:魚腥草有抗病、抗菌、解熱、抗炎鎮痛、升白細胞等作用［3］。魚腥草含有多種有效成分，如槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、阿福豆苷、瑞諾苷、金絲桃苷、蘆丁等黃酮類化合物［4］。蘆丁及其衍生物具有廣泛的藥理活性，臨床上主要用于防治腦出血、高血壓、視網膜出血、紫癜和急性出血性腎炎［5］。雖然有文獻對魚腥草中槲皮素［1］、綠原酸［6］等含量進行報道，但對魚腥草中蘆丁的含量分析，報道的比較少，據我們的現有文獻，僅見一篇文獻報道了魚腥草中蘆丁的含量［7］。對全國不同區域的魚腥草中蘆丁含量的分析比較未見報道。

本文主要對不同產地魚腥草的不同部位中蘆丁的含量進行分析，通過對蘆丁色譜條件的選擇及優化，建立測定魚腥草中蘆丁含量測定的方法，并通過此方法，對全國不同產地魚腥草不同部位的蘆丁含量進行分析，探討魚腥草不同產地和不同部位蘆丁的含量變化關系，以期為更好地利用和開發魚腥草提供理論和實驗依據。

1 儀器與試劑

Agilent 1200 高效液相色譜儀;CARY100 紫外-可見分光光度計;KQ3200B 超聲波清洗儀(余姚市亞星儀器有限公司);DJ-120A 電子天平(福州閔衡電子儀器有限公司)。

魚腥草藥材購于駐馬店同仁堂藥店，經河南省天方藥業有限公司王世兵博士鑒定。蘆丁標準品購于源葉生物科技有限公司(生產批號:20120226)。磷酸與甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流動相(A:0.1%磷酸水溶液，B:甲醇);柱溫:20 ℃;進樣量20 μL;流速:1.0 mL/min;檢測波長:358 nm。為了獲取較好的分離效果，經查閱相關文獻［8，11，12］我們設計如下三種梯度洗脫方案見表1。分別對提取液進行分離測定，比較其效果:

表1 梯度洗脫條件Table 1 Different gradient elution programmes

根據三種不同洗脫條件的方案分離魚腥草提取液所得到的HPLC 圖可知，在第I 種方案和第II 種方案的洗脫條件下所得的HPLC 圖譜分離度不高，尤其是第二種方案。而在第III 種方案的洗脫條件下所得的圖譜分離度高，蘆丁與前后兩個峰的分離度分別為R1=2.63，R2=2.15，適合于表征魚腥草中蘆丁的含量。所以本實驗采用第III 種方案的洗脫條件。

2.2 對照品溶液的制備

將20 mg 蘆丁標準品用體積濃度為70%的甲醇溶液定容至10 mL，然后分別配成7 個不同質量濃度的標準品對照溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取一定量的魚腥草莖(或葉)粉碎，過40 目篩，然后按1∶10 的料液比將5.000 g 魚腥草粉末加入50 mL 60%的甲醇溶液，于60 ℃超聲提取45 min，離心、過濾，得到生藥供試品溶液。所有供試品溶液經0.45 μm 微孔濾膜過濾，供HPLC 測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系

用甲醇溶液依次精確配制濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL 的蘆丁標準溶液，分別注入液相色譜儀，記錄蘆丁色譜峰的峰面積。以峰面積y 對濃度(mg/mL)進行回歸分析。得回歸方程為:

Y=28596X+18.102，R=0.9999

蘆丁在0. 02～0. 50 mg/mL 之間線性關系良好。

2.4.2 精密度

取魚腥草同一供試品溶液，按上述HPLC 條件，一日內連續測定3 次，計算峰面積值的相對標準偏差RSD 為0.94%。連續三日同一時間對供試品進行測量，計算峰面積值的相對標準偏差RSD 為2.75%。結果表明方法的精密度良好。

2.4.3 重現性

等量稱取一定質量的魚腥草粉末，平行做三組實驗，計算峰面積值的相對標準偏差RSD 為1.57%。結果表明重現性良好。

2.4.4 回收率

取5.000 g 魚腥草粉末加入2.0 mg 標準品，按2.3 節方法制備待測液，測定回收率，蘆丁的加標回收率為92.0%(n=3)。

2.5 樣品測定

按照“2.3”項下的方法對不同產地及不同部位的魚腥草粉末進行處理，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算蘆丁的含量。結果如下:

表2 樣品含量測定結果Table 2 Determination of samples

3 討論

魚腥草中所含化合物種類繁多，分離難度大，流動相的選擇是關鍵。本文通過不同方案的分離結果對比與理論計算得到一種分離度較好的梯度洗脫色譜條件。從實驗也可以看出色譜峰分離良好。

本論文首次在全國領域內，即中國的北部、中部和南部，對不同產地的魚腥草中蘆丁的含量進行測定對比，為魚腥草的開發提供依據。

從測定結果看，3 個不同產地魚腥草中蘆丁的含量差異較大，其中，產自貴州的蘆丁含量最高，而產自河南南陽的含量最低。在部位的比較中，魚腥草葉中蘆丁的含量普遍高于莖中的含量，大概是5到10 倍。該測定結果為魚腥草的高效利用提供理論依據。

該實驗方法操作快速、簡便、靈敏度高、重現性好，可使用于中草藥中蘆丁含量的測定。

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2 Chinese Phamacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:Chemical Industry Press，2010.

3 Mei SH(梅生華)，Liu XY(劉新泳).Progress in the studies of Houttuy cordata Thunb.Mod Enter Edu(現代企業教育)，2010(2):15-16.

4 Hu FL(胡鳳蓮)，Ni XL(倪細爐)，Liu WZ(劉文哲).Content variety of total flavone and quercetin in Houttuy cordata Thunb..Shanxi Normal Univ(陜西師范大學學報)，2007(S2):91-94.

5 Xia WM(夏維木)，Chen Q(陳杞)，Chen SM(陳士明)，et al.Application ESR technique for the observation of rutin on O2Removal Effect.Acade J Second Mil Med Univ(第二軍醫大學學報)，1997，18:388-389.

6 Luo SQ(羅世瓊)，Peng QC(彭全材)，Liu DD(柳丹丹)，et al.Determination of quercetin dihydrate in different parts of Houttuynia cordata Thunb by high performance liquid chromatography.J Jiangxi Normal Ubniv，Nat Sci (江西師范大學學報，自科版)，2008，26:96-99.

7 Peng QC(彭全材)，Yang ZN(楊占南)，Hu JW(胡繼偉)，et al.Determination of contents of seven flavonoids in Houttuynia Cordata Thunb by HPLC.J Jiangxi Normal Univ，Nat Sci (江西師范大學學報，自科版)，2008，32:645-648.