水果中阿斯巴甜的研究

金建秀 ，劉東華，石 杰，杜 平

新疆中基天然植物純化高新技術研究院有限公司，烏魯木齊830088

阿斯巴甜(Aspartame，APM，C14H18N2O5)，學名是天門冬酰苯丙氨酸甲酯，俗稱甜味素。最早由美國G.D.Searle 公司的研究人員在合成促胃液分泌激素時偶然發現其甜味，成為二肽類中第一個被發現有甜味的物質。由于其甜度高、熱量低、無不良后味和易與酸味食品調和等特點被廣泛用作食品、飲料的甜味劑。自1981 年美國食品和藥品管理局核準通過使用后，該甜味劑已經在超過100 個國家使用。

目前對阿斯巴甜的研究集中在合成［1］、應用［2］、安全性［3，4］及含量檢測［5-8］方面，對于天然植物中是否存在阿斯巴甜，在合成阿斯巴甜方法中必須的前體分子苯丙氨酸(Phe)、天冬氨酸(Asp)［9-11］和甲醇在水果中是否存在，與阿斯巴甜的對應關系尚未見報道。本文根據HPLC-QQQ-MS/MS 具有定性、定量及篩選能力強的特點，用HPLC-QQQ-MS/MS 分別對獼猴桃等8 種水果中的苯丙氨酸、天冬氨酸和阿斯巴甜進行測定，用HS-GC 分別對8 種水果中的甲醇進行測定。并進行模擬合成實驗，通過對合成產物進行測定，從化學角度對阿斯巴甜在水果中是否存在進行探討。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent RRLC1200 高效液相色譜儀，Triple Quad LC/MS 6410 三重四極桿串聯質譜儀，Agilent6890N GC 氣相色譜儀配有7694E 頂空進樣器、FID 檢測器(美國安捷倫科技公司);BS210S 電子天平(賽多利斯);勻漿機HR1617(飛利浦);離心機GT10-1(北京時代北利離心機有限公司);PHS-3B酸度計(上海雷磁)。

甲醇、甲酸、甲酸銨均為色譜純，購于美國TEDIA 公司;天冬氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜均＞99%，購于德國Dr.Ehrenstorfer 公司;丹酰氯＞95%，購于美國Sigma 公司;碳酸鉀、乙酸、乙酸銨、乙腈均為分析純，購于天津市福晨化學試劑廠;橙、獼猴桃、桔、菠蘿、芒果、蘋果、香梨、香蕉均購自市場。

1.2 標準溶液的配制

苯丙氨酸和天冬氨酸標準溶液:準確稱取苯丙氨酸和天冬氨酸標準品各10.0 mg 分別于2 個100 mL 容量瓶中，加入2 mL 水及5 滴10%碳酸鉀溶液溶解，定容至刻度，制成100 mg/L 的苯丙氨酸和天冬氨酸標準儲備液。分別移取兩種標準儲備液5.0 mL 于2 個100 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到5.0 mg/L 的苯丙氨酸和天冬氨酸工作液。

阿斯巴甜標準溶液:準確稱取阿斯巴甜標準品10.0 mg 于100 mL 容量瓶中，用pH = 4.5 的緩沖溶液(乙酸-乙酸銨)定容至刻度，得到100 mg/L 的標準儲備液。將此標準儲備液用緩沖溶液逐級稀釋成0.5、5.0、10.0、50.0 μg/L 的工作液。

丹酰氯標準溶液:準確稱取丹酰氯標準品50.0 mg 于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制得500 mg/L 的工作液。

甲醇標準溶液:準確稱取甲醇100 mg 于100 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到1.0 g/L 的甲醇標準儲備液。移取此儲備液2.0 mL 于10 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到200 mg/L 的甲醇標準溶液。

1.3 樣品制備

1.3.1 測定水果中pH 值的樣品制備

將水果去皮切碎，與水按質量比1∶2 的比例進行勻漿，取勻漿后樣品適量，于9000 rpm 轉速下離心5 min，取上清液，用pH 計測定其pH 值。

1.3.2 測定水果中甲醇含量的樣品制備

取1.3.1 中制備的勻漿樣品兩份，每份8.0 g，分別至2 個20 mL 頂空瓶中，一份加1.0 g/L 甲醇溶液2.0 mL，得到甲醇濃度為200 mg/L 的加標樣品;另一份加蒸餾水2. 0 mL，得到空白樣品。用GC-HS 分析。

1.3.3 測定水果中阿斯巴甜含量的樣品制備

取1.3.1 中制備的勻漿樣品15 mL，加入20%乙腈溶液15 mL，混勻，于9000 rpm 轉速下離心5 min 后，移取樣品上清液于2 個10 mL 容量瓶中，每份5.0 mL，一份加50.0 μg/L 阿斯巴甜標準液2.0 mL，用緩沖液定容至刻度，得到濃度為10.0 μg/L的加標樣品;另一份用緩沖液定容至刻度，作為空白樣品。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.3.4 測定天冬氨酸和苯丙氨酸含量的樣品制備

1.3.4.1 測定2種氨基酸標準溶液反應液中衍生物含量的樣品制備

分別移取5.0 mg/L 的天冬氨酸標準溶液5.0 mL 和5.0 mg/L 苯丙氨酸標準溶液1.0 mL 于2 個試管中，并在苯丙氨酸溶液的試管中加4.0 mL 水，再分別向兩支試管中加500 mg/L 的丹酰氯標準溶液1.0 mL，滴加10%碳酸鉀溶液，使試液pH 為9.5左右，最后各加乙腈5 mL，于35 ℃水浴中暗反應1 h。將反應液分別移至2 個100 mL 容量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，得到0.25 mg/L 的天冬氨酸衍生物溶液和0.05 mg/L 的苯丙氨酸衍生物溶液。移取上述兩種氨基酸衍生物溶液各1.0 mL 于1 個10 mL 容量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，得到濃度為25.0 μg/L 的天冬氨酸衍生物和5.0 μg/L 的苯丙氨酸衍生物混合標準溶液。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.3.4.2 測定水果中2 種氨基酸衍生物含量的樣品制備

移取1.3.3 制備的樣品上清液0.5 mL，定容至10 mL(試液I)。分別移取試液I 0.2 mL 至2 個試管中，一份加0.25 mg/L 的天冬氨酸衍生物溶液和0.05 mg/L 的苯丙氨酸衍生物溶液各1.0 mL，另一份加2 mL 水。分別向兩支試管中滴加10%碳酸鉀溶液，調試液pH 至9.5 左右，再各加500 mg/L 的丹酰氯標準溶液5.0 mL，最后各加乙腈1 mL，于35℃水浴中暗反應1 h。將反應液分別移至2 個10 mL 容量瓶中，定容至刻度。得到一份濃度為25.0 μg/L 的天冬氨酸衍生物和5.0 μg/L 的苯丙氨酸衍生物混合樣品溶液，另一份為空白樣品溶液。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.3.5 測定模擬合成反應中阿斯巴甜含量的樣品制備

移取5.0 mg/L 的天冬氨酸及苯丙氨酸標準溶液各5 mL 于一個試管中，加入2 mL 甲醇和0.2 mL乙酸，再加約3 mL 水，在50 ℃水浴下反應8 h。用HPLC-QQQ-MS/MS 分析。

1.4 液相-質譜條件

1.4.1 測定氨基酸衍生物的液相條件

Agilent Eclipse XDB-C18 色譜柱(50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)。流動相:A 為含0.1%甲酸的水溶液;B 為甲醇。梯度洗脫程序:0～1.0 min，35%B;1.0～3.0 min，35%B～90%B;3.0～ 8. 0 min，90%B;8.0～8.1min，90%～35%B。流速:0.2 mL/min。柱溫:40 ℃。進樣量:5 μL。

1.4.2 測定阿斯巴甜的液相條件

色譜柱、流速、柱溫、進樣量與1.4.1 相同。流動相:0.1%甲酸水溶液-甲醇(82:18，V/V)。

1.4.3 質譜條件

離子源:ESI+模式;監測模式:MRM;電噴霧電壓:4000 V;霧化氣壓力:2.76 ×105Pa;反吹氣溫度:350 ℃，其它質譜參數見表1。

表1 天冬氨酸衍生物、苯丙氨酸衍生物及阿斯巴甜的母離子、子離子、碎裂電壓和碰撞能量Table 1 Parent ion，product ion，fragmentor and collision energy of MS for aspartic acid derivative，phenylalanine derivative and aspartame

圖1 5.0 μg/L 阿斯巴甜(APM)標準溶液與8 種水果空白樣品中阿斯巴甜的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of aspartame in aspartame standard solution (5.0 μg/L)and eight kinds of fruit samples

1.5 氣相色譜-頂空進樣條件

1.5.1 氣相色譜條件

DB-WAX 色譜柱(30 m × 0. 32 mm × 0. 25 μm);柱流量:1.5 m/min;分流比:5∶1;進樣口溫度:200 ℃;柱溫:60 ℃;FID 檢測器溫度:250 ℃。

1.5.2 頂空進樣器條件

樣品平衡時間:20 min;樣品平衡溫度:60 ℃;定量環溫度:80 ℃;加壓時間:0.2 min;定量環平衡時間:0.05 min;進樣時間:1.0 min;定量環充樣時間:0.2 min;傳輸線溫度:90 ℃。

2 結果與討論

2.1 LC-QQQ-MS/MS 條件的優化

在阿斯巴甜的檢測中，甲酸濃度顯著影響阿斯巴甜的保留時間，濃度增高保留時間延長;添加甲酸銨則會明顯抑制阿斯巴甜的離子化。此外，多種樣品基質會產生m/z 120 的干擾峰，通過調節流動相比例，能使目標峰與干擾峰完全分離。經過優化，選擇1.4.2 條件，能兼顧運行時間和分離度的要求(見圖1)。

對樣品中天冬氨酸和苯丙氨酸的測定是通過將其衍生化反應后測定其衍生物來實現的。兩種氨基酸衍生物在色譜柱上的保留差別很大，天冬氨酸衍生物保留較弱，苯丙氨酸衍生物保留很強，實驗證實流動相中甲酸和甲酸銨的含量對其分析影響不大。選擇1.4.1 條件，能兼顧運行時間和分離度的要求(見圖2)。

本實驗中，阿斯巴甜在ESI+和ESI-電離模式下均具有較強的質譜信號，其ESI+模式質譜信號略強于ESI-模式的，天冬氨酸衍生物和苯丙氨酸衍生物在ESI+模式下具有遠強于ESI-模式下的質譜信號，因此均選用ESI+電離模式進行測定。采用MRM 監測模式，阿斯巴甜和兩種氨基酸衍生物的母離子經碰撞后產生一系列子離子，通過對碎裂電壓和碰撞能量的優化，選擇響應最高的一組離子為定性和定量離子。優化后的質譜參數見表1。

圖2 25.0 μg/L 天冬氨酸(Asp)和5.0 μg/L 苯丙氨酸(Phe)衍生物的混合標準溶液與8 種水果空白樣品中天冬氨酸及苯丙氨酸衍生物的MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of aspartic acid derivative and phenylalanine derivative in mixed standard solution (25.0 μg/L for aspartic acid derivative，5.0 μg/L for phenylalanine derivative)and eight kinds of fruit blank samples

2.2 基質效應

基質效應(Matrix Effect)，即指樣品中除分析物以外的共流出組分改變了分析物的響應值，從而影響定量分析的準確性與重現性。實驗中用加標樣品的峰面積與空白樣品的峰面積的差值占加標濃度的標準溶液的峰面積的百分比來計算衡量［12］，大于100%表示基質增強效應，小于100%表示基質抑制效應。8 種水果在LC-QQQ-MS/MS 分析中天冬氨酸和苯丙氨酸衍生物及阿斯巴甜的基質效應影響如圖3 所示。

2.3 HS-GC 條件的優化

本實驗主要優化柱溫，經比較60 ℃的柱溫較合適，能做到目標物峰與雜峰的基線分離(見圖4)。

圖3 8 種水果在LC-QQQ-MS/MS 分析中天冬氨酸(Asp)和苯丙氨酸(Phe)衍生物及阿斯巴甜(APM)的基質效應Fig.3 Matrix effects of aspartic acid derivative，phenylalanine derivative and aspartame by LC-QQQ-MS/MS in the eight kinds of fruit simples

圖4 200 mg/L 甲醇標準溶液和8 種水果空白樣品中甲醇的GC 色譜圖Fig.4 GC chromatograms of methanol in methanol standard solution (200 mg/L)and eight kinds of fruit blank samples

2.4 定量方法的選擇

因基質效應的影響，定量方法采用標準加入法。在實驗中，為提高定量結果準確度，盡量使加標溶液濃度與樣品濃度接近。天冬氨酸和苯丙氨酸衍生物及阿斯巴甜的峰面積從提取離子流圖(EIC)中獲取(可以有效消除雜質峰的干擾，提高定量準確性)，甲醇的峰面積從GC 色譜圖中獲取。計算方法如下:

Pi=Ai/(As+i-Ai)×Cs×F

Pi:樣品中組分i 的含量，mg/kg 或μg/kg;

Cs:加標溶液的濃度mg/kg 或μg/kg;

Ai:樣品中組分i 的峰面積;

As+i:加標樣品的峰面積;

F:稀釋因子。

2.5 樣品的測定

2.5.1 8 種水果樣品pH 值的測定

取1.3.1 中制備的樣品上清液測定pH 值，結果見表2。

實驗結果表明8 種水果樣品提取液均呈弱酸性，而弱酸性環境對阿斯巴甜的穩定存在是有利的。

2.5.2 8 種水果樣品中甲醇、天冬氨酸、苯丙氨酸含量的測定

分別按1.3.2、1.3.4、1.3.3 的方法制備樣品，測定水果及其加標樣品中的甲醇、天冬氨酸、苯丙氨酸和阿斯巴甜。結果(見表3)表明，8 種水果均含有甲醇、天冬氨酸、苯丙氨酸和阿斯巴甜。

表2 8 種水果樣品的pH 值Table 2 pH values of eight kinds of fruit samples

表3 8 種水果中甲醇、天冬氨酸(Asp)、苯丙氨酸(Phe)和阿斯巴甜(APM)的含量Table 3 The contents of methanol，aspartic acid(Asp)，phenylalanine(Phe)and aspartame(APM)in eight kinds of fruit

2.5.3 模擬合成反應產物中阿斯巴甜的測定

在模擬合成反應中，用甲酸代替水果中常見的檸檬酸或蘋果酸，該體系若能產生一些縮合產物，可以預期將是比較復雜的混合物。按照1.3.5 方法模擬合成反應實驗后進樣測定。結果(見圖5)表明，反應液的MRM 色譜圖中存在與阿斯巴甜標準溶液譜圖中保留時間相同的色譜峰，再將產物與阿斯巴甜標準溶液的MRM 色譜圖進行比較:定量離子與定性離子相同;定量與定性離子豐度比率相近，因此，可以確認模擬合成反應中有阿斯巴甜生成，約1.4 μg/L。模擬反應實驗證明，在酸性環境條件下，當體系中具備合成阿斯巴甜的前體分子，是可以形成阿斯巴甜的。但是，果實中阿斯巴甜的濃度比實驗反應生成的濃度高許多，這與生物系統合成有機物的高效性是否相關，目前尚不清楚。

3 結論

圖5 反應液與5.0 μg/ L 阿斯巴甜標準溶液匹配后的MRM 色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of aspartame in the reaction solution and aspartame standard solution (5.0 μg/L)after chromatographic peak matching

本文采用高效液相色譜-串聯質譜技術建立了水果中天冬氨酸、苯丙氨酸和阿斯巴甜的分析方法，采用頂空-氣相色譜技術建立了水果中甲醇的分析方法。將所建立的方法用于測定8 種水果中的目標成分，結果顯示8 種水果中均存在阿斯巴甜、天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇，其中甲醇、天冬氨酸和苯丙氨酸的含量差異較大，而阿斯巴甜的含量差異不大，兩者缺乏對應關系。設計阿斯巴甜的模擬合成實驗，表明阿斯巴甜有在水果中合成的可能。

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