響應面法優化超聲輔助提取太子參多糖工藝研究

林志娟，陳 永* ，尤麗彤，孫鳳祥，李桂芝

1濰坊醫學院基礎醫學院;2 濰坊醫學院2008 級藥學專業，濰坊261053

太子參，又名孩兒參、童參，為石竹科多年生植物異葉假繁縷［Pseudostellaria hetero phylla (Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.］的塊根，具有益氣健脾、生津潤肺之功效，臨床常用于脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足。實驗研究表明太子參多糖是其主要藥物活性成分之一，具有抗疲勞、抗應激和增強機體免疫功能等作用［1，2］，同時對由四氧嘧啶導致的糖尿病小鼠具有顯著治療作用［3］，具有較高的開發和應用價值。然而，目前關于太子參多糖提取方法工藝的研究相對較少。

超聲波提取是利用超聲波具有的機械效應、空化效應及熱效應，通過增大介質分子的運動速度，增大介質的穿透力以提取天然產物有效成分的方法。具有提取時間短、提取效率高等優點［4］。

目前，多糖提取工藝優化多為均勻設計和正交設計，此類方法不能考察因素之間的相互作用，同時也很難考察多個響應值與因素之間的交互作用關系。響應面分析法(response surface methodology，RSM)是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法。通過局部實驗回歸擬合因素與結果間的全局函數關系，從而得到準確有效的實驗結論，能在整個考察區域上確定各個因素的最佳組合及最優響應值。響應曲面法以其試驗次數少周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用的諸多優點［5］，現已廣泛應用于工藝條件優化等領域。本研究在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法進一步優化太子參多糖超聲輔助提取工藝，以期得到最佳提取工藝參數，為太子參多糖的進一步開發利用提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太子參，購自濰坊本草閣大藥房，60 ℃烘干，粉碎，過100 目篩。濃硫酸、苯酚、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

WKX-230 風選中藥粉碎機:山東青州市精誠機械制造有限公司;KQ-100DB 型數控超聲清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;HC-3018 高速離心機:安徽中科中佳科學儀器有限公司;722S 可見分光光度計:上海棱光技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 太子參多糖提取工藝

準確稱取太子參粉10 g，按比例加入蒸餾水浸泡3 h，按試驗設計進行超聲浸提。提取液70 ℃減壓濃縮，離心除去沉淀，Sevage 法脫蛋白3 次，蒸餾水透析24 h，然后加入3 倍體積無水乙醇沉淀過夜，離心，沉淀用無水乙醇、丙酮洗滌，干燥后得太子參多糖。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的制備—苯酚硫酸法［6］

精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖100 mg，定容至1000 mL，搖勻即得0.10 mg/mL 的葡萄糖溶液，作為標準溶液。精密量取葡萄糖標準溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL 分別置于具塞試管中，分別加水至0.5 mL，空白對照為蒸餾水0.5 mL，各加5 %苯酚(重蒸)溶液0.5 mL，混勻，加濃硫酸2.5 mL，迅速振搖混勻，于室溫下放置30 min，490 nm 處比色，以吸光度(A)為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 多糖測定及提取得率計算

精密稱取干燥至恒重的太子參多糖樣品10 mg溶于適量蒸餾水中，100 mL 容量瓶定容，既得0.1 mg/mL 多糖溶液。吸取多糖溶液0.5 mL 至具塞試管中，苯酚-硫酸法測定多糖含量，按多糖提取得率(% )= (多糖質量/樣品質量)×100 %計算太子參多糖提取得率。

1.3.4 多糖提取的單因素試驗

以提取時間45 min，提取溫度70 ℃，超聲波功率80%，液料比20∶1 為基本條件，分別考察超聲波功率、提取時間、提取溫度及水料比各單因素變化對多糖提取得率的影響。

1.3.5 響應面法優化試驗設計

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken 試驗設計方案［7-9］，進一步優化超聲法提取太子參多糖的條件。試驗以太子參多糖提取得率為響應值(Y)，分別用X1、X2、X3表示提取溫度、提取時間和水料比3 個自變量，并以-1、0、1 分別表示3 個水平，按方程xi=(Xi-X0)/△X 對自變量進行編碼。式中:xi為自變量的編碼值;Xi為自變量的真實值;X0為試驗中心點處自變量的真實值;△X 為自變量的變化步長。試驗因素及水平編碼如表1 所示，具體試驗設計方案見表2。

表1 太子參多糖提取得率響應面分析因素水平及編碼Table 1 Variables and levels of response surface analysis

表2 Box-Behnken 設計方案及太子參多糖提取得率測定值Table 2 Box-Behnken design matrix and extraction yield of Radix Pseudostellariae polysaccharides

采用Design-Expert.v.8.0.5 對試驗數據進行回歸分析，擬合二次多項式方程，方程可靠性由R2表達，其統計學上的顯著性由F 值檢驗。影響因素線性效應、平方效應及其交互效應的顯著性由模型系數的P 值檢驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲波功率

由圖1 可以看出在其它條件不變的情況下，隨著超聲波功率的增大，太子參多糖的提取得率逐步提高，當功率達到100 W 時多糖提取得率達到最大值，為傳統水提法(即超聲波功率為0 時太子參多糖的提取得率)的1.85 倍，表明在儀器額定功率范圍內，隨超聲波功率的增大，太子參多糖提取得率逐步提高。因此，在試驗中為提高多糖提取得率，將超聲功率設為100 W 的額定功率。

圖1 超聲波功率對提取得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on the extraction yield

2.1.2 提取時間

在保持其它條件不變，改變提取時間時，太子參多糖提取得率的變化情況如圖2 所示。有圖可見，在提取時間小于60 min 時，隨提取時間的延長，提取效率提高顯著，隨后再延長提取時間，提取得率不再增加，且略有降低。這表明多糖的浸出過程與時間密切相關，時間過短，多糖溶解不充分;而達到一定的提取時間后，原料中多糖已充分浸出，故得率不再增加。但時間過長，又會引起多糖結構的變化進而使得率降低。為縮短工時、減少能耗，太子參多糖的提取時間選擇60 min 左右較為合適。

圖2 提取時間對提取得率的影響Fig.2 Effects of extraction time on the extraction yield

2.1.3 提取溫度

其它條件不變，考察提取溫度對多糖提取得率的影響，結果發現，提取溫度小于70 ℃時，隨著提取溫度的升高，太子參多糖提取得率明顯增加，而溫度大于70 ℃后，多糖提取得率有所下降，如圖3 所示。可能是高溫條件下部分多糖水解的結果，這也與大多數多糖提取工藝研究結果一致，因此太子參多糖的提取溫度選擇70 ℃左右為宜。

圖3 提取溫度對提取得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on the extraction yield

2.1.4 水料比對太子參多糖提取得率的影響

其它條件不變，考察水料比對多糖提取得率的影響，結果如圖4 所示，隨水料比的增大多糖提取得率有增加的趨勢，水料比大于25 mL/g 后多糖提取得率下降。分析原因為提取液過少時多糖提取不充分導致提取得率過低，提取液比例過大時，超聲波輻射被溶劑大量吸收，不能完全作用于物料，從而影響多糖提取得率。因此太子參多糖提取的水料比為25 mL/g 左右時能獲得最高的提取得率。

圖4 水料比對提取得率的影響Fig.4 Effects of liquid to solid ratio on the extraction yield

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 二次回歸模型擬合及方差分析

各處理組合的試驗結果見表2，應用Design-Expert 7.0 軟件對表2 的試驗結果進行多元回歸擬合獲得太子參多糖提取得率(Y)對提取溫度(X1)、提取時間(X2)、水料比(X3)3 個自變量的二次多項式回歸方程為:Y= 2.35 +0.32x1+0.11x2+0.096x3-0. 068x1x2+ 0. 077x1x3-0. 035x2x3-0. 42x-0. 18x-0.30x對回歸方程進行方差分析，結果見表3。

由表3 可知，模型的F 檢驗結果為P ＜0.0001，表明該回歸模型極其顯著，且模型失擬項P =0.1034 ＞0.05 不顯著，復相關系數R2=0.9846，說明模型擬合程度很好。校正系數R2=0.9475 說明該模型能解釋94.75%響應值的變化，僅有總變異的5.25%不能用此模型來解釋。因此試驗值與預測值非常接近，可以用此模型來分析和預測超聲法提取太子參多糖的工藝條件。由表3 中回歸模型的方差結果分析可知，提取溫度、提取時間、水料比3因素對多糖提取得率均有顯著影響，它們對提取得率的影響排序為提取溫度(X1)＞提取時間(X2)＞水料比(X3)。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance with regression model

2.2.2 響應面交互作用分析與優化

為了進一步研究相關變量之間的交互作用以及確定最優點，我們通過Design-Expert 軟件繪制了響應面曲線圖，見圖5～7。比較響應面三維圖可知，在所選范圍內存在極值，即響應面最高點。圖5 表明，提取溫度低、時間短時，多糖提取得率低;但過高的提取溫度、過長的提取時間會導致多糖提取得率的下降，這可能是由于時間長，溫度高使多糖分解所致，規律與單因素試驗基本一致。

圖7 提取時間與水料比對太子參多糖提取得率的響應面圖Fig.7 Three-dimensional response surface plot of mutual effects of extraction time and liquid/solid ratio on extraction yield

由圖5、圖6 及圖7 響應面立體圖可以看出，響應值存在極值，即響應面最高點，進一步通過Design-Expert 軟件分析計算可知，當提取溫度為73.8℃，提取時間為63.5 min，水料比為25.9 mL/g 時，太子參多糖提取得率達到最大值，為2.43%。考慮到實驗的可操作性，把上述條件修正為提取溫度為74 ℃，提取時間為65 min，水料比為26 mL/g，并設超聲波功率為100 W。

在修正條件下對實驗結果進行驗證實驗，重復3 次，得到太子參多糖平均提取得率為2.48%相對預測值誤差為2.1%，二者非常接近，說明該工藝穩定可行，適合太子參多糖提取。

3 結論

本研究首先通過單因素實驗選定了參與響應面試驗的提取時間、水料比以及提取溫度3 個主要因素并設立不同水平，然后應用響應面分析法建立了影響太子參多糖提取得率的二次多項數學模型，經檢驗該模型具有顯著的統計學意義，可用于生產預測。

實驗結果表明提取溫度、提取時間及水料比各因素及其二次項對多糖提取得率均有顯著影響。綜合考慮各方面的因素，超聲輔助提取太子參多糖的優化條件是:提取溫度為74 ℃，提取時間為65 min，水料比為26 mL/g，超聲波功率為100 W，此條件下太子參多糖的提取得率可達2.48%。該結果可為太子參多糖提取的工業化生產提供理論參考依據。

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