七葉一枝花內生真菌Penicillium sp. (No.4)聚酮類次級代謝產物研究

劉艷輝，楊 旋，李九玲，郭志勇 ，鄧張雙，涂 璇，陳劍鋒，鄒 坤

化學與生命科學學院 天然產物研究與利用湖北省重點實驗室 三峽大學，宜昌443002

聚酮類化合物是一類具有復雜結構天然產物，特別是眾多真菌和放線菌的主要次級代謝產物。大多數的抗生素，部分抗腫瘤藥物及免疫抑制劑等都屬于聚酮類化合物如紅霉素，絲裂霉素等。由于該類化合物具有豐富的結構和生物活性多樣性而成為天然產物研究的熱點，如cladoacetal A，B［1］，massarigenin A-D［2］，berkeleyacetal A-C［3］，Maklamicin［4］，22-Epoxyberkeleydione，berkeleydione，Miniolutelide A［5］，Berkeleydione，Berkeleytrione［6］，Tenuipyrone［7］，Codinaeopsin［8］。從神農架地區瀕危藥用植物內生菌中尋找活性次級代謝產物過程中發現來自七葉一枝花葉片的內生真菌Penicillium sp. 的粗提物對肝癌細胞有較強的抑制活性，進一步的發酵，萃取，分離，鑒定得到八個聚酮類化合物1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌(1)，bostrycin (2)，isorhodoptilometrin (3)，physcioin (4)，emodin (5)，aloesol(6)，coniochaetone B (7)，2，5-dimethyl-7-hydroxychromone (8)，其中化合物1 為一新天然產物。本文報道了化合物1～8 的結構鑒定及其體外抑制肝癌細胞的活性。

圖1 化合物1～8 的結構圖Fig.1 The structures of compounds 1-8

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

X-4 數字顯示顯微熔點儀(溫度未校正)(北京泰克儀器有限公司);Bruker 400 核磁共振波譜儀;Finnigin 電噴霧質譜儀;Varian prostar 高效液相色譜儀;AL204 電子天(METTLWR TOL EDO);S23100紫外分光光度計(SCINCO);N21001 型旋轉蒸發儀(上海愛郎儀器有限公司)等;柱色譜和薄層色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產品，其它試劑均為分析純。

1.2 菌種

Penicillium sp.菌株是采自神農架地區的瀕危藥用植物七葉一枝花的葉片，菌種保存在三峽大學化學與生命科學學院天然產物研究利用湖北省重點實驗室內，保存在4 ℃的PDA 的培養基中。

1.3 菌種發酵培養

采用固體發酵方式，500 mL 三角瓶內裝60 g 大米，120 mL 蒸餾水，經121 ℃(0.1 MPa)高溫滅菌25 min 后在超凈工作臺上接種，共接種50 瓶，于室溫靜置培養40 d。

1.4 提取分離

真菌Penicillium sp. 在大米培養基上發酵完畢后，于三角瓶中搗碎培養基，加入適量乙酸乙酯，置于200 rpm 搖床上振搖12 h，重復提取三次，合并收集乙酸乙酯，經旋轉蒸發儀濃縮得浸膏15 g，浸膏經200～300 目硅膠拌樣，上正相硅膠柱，用不同濃度的石油醚-乙酸乙酯，及乙酸乙酯-甲醇的梯度洗脫，收集各組分，經TLC 分析合并，得到8 個不同的片段，片段4 和7 經反復的硅膠柱層析，Sephadex LH-20，HPLC 制備等得到化合物1～8，其中1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌(1)10 mg，bostrycin (2)30 mg，Isorhodoptilometrin (3)20 mg，physcioin (4)10 mg，大黃素(5)8 mg，aloesol (6)7 mg，coniochaetone B (7)10 mg，2，5-dimethyl-7-hydroxychromone(8)8 mg.

1.5 抗肝癌活性實驗

用MTT 法檢測8 個化合物對Hep G2 細胞的細胞毒活性。從母液開始，依次4 倍稀釋，共5 個梯度，對數生長期的Hep G2 細胞分別接種于96 孔板，每孔100 μL (約1 ×104 個細胞/孔)，6 h 后加入25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78 μg/mL 不同濃度藥物100 μL，每一濃度3 個重復孔，培養24 h 后加入MTT 10 μL (質量濃度為5 mg/mL)，繼續培養4 h 后棄上清，每孔加入二甲基亞砜100 μL 后用酶聯免疫檢測儀測定492 nm 處吸光度OD 值，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率=(實驗組平均OD值/ 對照組平均OD 值)×100 %。

2 結果與討論

化合物1 為黃色無定型固體，其一維的氫譜和碳譜顯示出來的信息非常簡單，其一維氫譜中顯示七組氫信號峰，其中位于δ 7.47 (s，1H)的氫信號顯示該化合物可能存在一個2，3，4，5，6-五取代苯環，位于δ 7.56 (d，2.0，1H)，7.23 (d，2.0，1H)的氫信號表明化合物1 中可能存在一個1，3，4，5-四取代苯環。其余氫信號均為處于高場的甲基和甲氧基信號分別位于δ 2.45 (s，3H)，3.89 (s，3H)，3.95(s，3H)，3.94 (s，3H)。其一維碳譜顯示出蒽醌類化合物的特征，包括位于δ 185.4 和183.8 的羰基信號，還 有位 于δ 161. 1，155. 2，149. 9，147. 0，136.8，136. 8，125. 3，122. 6，122. 2，120. 5，119. 4，106.4 芳香碳信號，位于δ 61.4，56.9，56.5，22.2 甲基信號，綜合分析上述一維NMR 圖譜發現該化合物為蒽醌類多羥基(甲氧基)取代的衍生物。HMBC 是不能確定其準確取代位置。通過進一步的NOESY 譜分析表明，H-4 與H-12 存在NOE 效應，表明H-4 處于12 位甲氧基的鄰位，剩余的羥基與一個甲氧基的位置關系，因為沒有相應的HMBC 與NOE相關而不能通過NMR 證據證實，經與文獻比較發現［9］，當1 位是甲氧基2 位是羥基時，其NMR 數據與文獻值相符，因而確定該部分的三個取代基之間的相對位置關系;在NOESY 中，同樣我們也觀察到H-5 與H-13，H-7 與H-13，H-7 與H-14 的相關關系存在，這就更加證明前面HMBC 的結果，即H-5，H-7，H-13 及H-14 的相互之間的位置關系。因此確定化合物為1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌，通過文獻檢索，發現該化合物1 為一合成產物［10］，首次從天然界分離得到，為一新的天然產物。

圖2 化合物1 主要HMBC 和NOESY 相關關系ig.2 The key HMBC and NOESY correlations of compound 1

表1 化合物1 的NMR 數據Table 1 The NMR data of compound 1(1H，400 MHz，13C，100 MHz，CD3OD-d4)

化合物2 為淡黃色無定形粉末，熔點252～253 ℃，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6):13.4 (s，1H)，12.6 (s，1H)，6.47 (s，1H)，5.26 (d，5.2，1H)，4.96 (d，4.4，1H)，4.74 (t，4.8，1H)，4.51(s，1H)，3.51 (t，4.4，1H)，2.69 (dd，8，18，2H);13C NMR (400 MHz，DMSO-d6):184.5，177.7，160.5，160.2，160.1，139.5，136.8，110.0，109.9，107.6，76.4，69.4，68.3，57.0，34.9，25.7。通過查閱文獻對比發現化合物2 與bostrycin 的波譜數據一致［11］，因而確定化合物2 為bostrycin。

化合物3 紅色固體，1H NMR(400 MHz，Acetone-d6):12.22 (s，1H)，12.17 (s，1H)，12.10 (s，1H)，7.66 (d，2.4，1H)，7.21 (d，1.6，1H)，7.26(d，2.4，1H)，6.66 (d，1.8，1H)，4.09 (m，1H)，2.85 (dd，5.0，12.8，2H)，1.22 (d，6.2，3H);13C NMR(100 MHz，Acetone-d6):191.6，182.3，166.9，166.3，166.0，151.3，136.6，134.0，125.6，122.0，114.8，110.2，109.9，108.8，68.2，46.4，23.8。通過查閱文獻發現化合物3 與Isorhodoptilometrin 的波普數據一致［12］，因而確定化合物3 為Isorhodoptilometrin。

化合物4 橙紅色固體，熔點202～203 ℃，1H(400 MHZ，Acetone-d6):12.31 (s，1H)，12.11 (s，1H)，7.63 (dd，1.5，0.5 Hz，1H)，7.37 (d，2.5 Hz，1H)，7.08 (dd，2.5，1.0 Hz，1H)，6.69 (d，2.5 Hz，1H)，3.94 (s，3H)，2.45 (s，3H);13C (100 MHZ，Acetone-d6):190.8 (C)，182.0 (C)，166.6 (C)，165.2(C)，162.5(C)，148.4(C)，135.3(C)，133.2(C)，124.5 (C)，121.3 (C)，113.7 (C)，110.3(CH)，108.2 (C)，106.8 (CH)，56.1 (CH3)，22.1(CH3)通過與文獻對比發現化合物4 與大黃素甲醚的波譜數據一致［13］，因而確定化合物4 為大黃素甲醚。

化合物5 橙紅色固體，1H (400 MHZ，Acetoned6):12.15 (1H，s)，12.03 (1H，s)，10.16(1H，s)，7.54 (1H，d，J = 1.2 Hz)，7.25(1H，d，2.4 Hz)，7.14(1H，d，0.6 Hz)，6.66(1H，d，2.4Hz)，2.45(3H，s);13C (100 MHZ，Acetone-d6):192.3，182.6，167.2，167.0，164.4，150.6，137.4，135.0，125.5，122.1，118.5，115.3，110.6，109.8，23.1;通過與文獻對比發現化合物5 與大黃素的波譜數據一致［13］，因而確定化合物5 為大黃素。

化合物6 無色晶體，熔點196～198 ℃，1H NMR(400 MHz，Acetone-d6):6.65(d，2.0，1H)，6.63 (br s，1H)，6.05 (s，1H)，4.19 (dd，5.6，6.2，1H)，2.72 (s，3H)，2.68 (m，2H)和1.27 (s，3H);13C NMR(100 MHz，Acetone-d6):182.0 (C)，167.0 (C)，163.8 (C)，161.6(C)，143.5(C)，118.4 (CH)，115.6 (C)，112.5 (CH)，101.8(CH)，66.4(CH)，44.2(CH2)，23.5(CH3)，23.1(CH3);通過查閱文獻發現化合物6 與aloesol 的數據一致［14］，因而確定化合物6 為aloesol。

化合物7 白色晶體，熔點200～202 ℃;1H NMR(400 MHz，Acetone-d6):6.82 (s，1H)，6.61(s，1H)，5.27 (d，6.8，1H)，3.15 (q，7.6，16.2，1H)，2.86 (dd，3.6，9.2.1H)，2.45 (m，1H)，1.96(m，1H)2.43 (s，3H);通過查閱文獻發現化合物7與coniochaetone B 的波譜數據一致［15］，因而確定化合物7 為coniochaetone B。

化合物8 無色晶體，熔點158～159 ℃，1H NMR (400 MHz，acetone-d6):6.64 (s，1H)，6.63(s，1H)，6.00(s，1H)，2.32(s，3H);13C NMR(100 MHz，acetone-d6):182.0 (C)，166.6 (C)，163.3(C)161.5 (C)，143.6 (C)，118.1 (CH)，115.5(C)，111.4 (CH)，101.7 (CH)，19.8 (CH3)。通過查閱文獻［16］，該化合物與2，5-dimethyl-7-hydroxychromone 的波普數據一致，因確定化合物8 為2，5-dimethyl-7-hydroxychromone。

化合物1～8 采用MTT 方法評價其體外抑制肝癌細胞活性，結果顯示化合物1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌(1)，bostrycin (2)和isorhodoptilometrin (3)對肝癌細胞有較強的抑制活性，其IC50分別為15.6，5.8，13.2 μg/mL 化合物，而化合物4～8 的IC50值均大于50 μg/mL。

從瀕危藥用植物七葉一枝花內生真菌Penicillium sp. (NO.4)中分離得到八個化合物，經核磁共振，質譜等手段鑒定其結構分別為1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌(1)，bostrycin (2)，isorhodoptilometrin (3)，physcioin (4)，emodin (5)，aloesol(6)，coniochaetone B (7)，2，5-dimethyl-7-hydroxychromone (8)，其中化合物1 為一新天然產物。體外細胞毒活性顯示化合物1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌(1)，bostrycin (2)和isorhodoptilometrin(3)對肝癌細胞有較強的抑制活性，其IC50分別為15.6，6.5，13.2 μg/mL。本文研究結果表明內生菌具有產生各種活性次級代謝產物的能力，同時為那些瀕危藥用植物的保護與開發提供了新的途徑。

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