超聲集成雙水相體系提取葡萄籽中的原花青素

張喜峰，李彩霞，張 瑾，張芬琴

河西學院農業與生物技術學院，張掖734000

在葡萄酒加工過程中，每年產生約占葡萄加工量20%～30%的大量皮渣廢棄物，其中主要是葡萄皮、種子和果梗等。葡萄籽中含有原花青素、葡萄籽油、白藜蘆醇、維生素、單寧等多種功能性成分［1，2］。其中原花青素具有抗氧化，清除自由基，保護心血管，預防高血壓等多種藥理活性作用［3，4］。

目前原花青素的提取方法有微波萃取、超聲波提取、超臨界萃取法、膜分離技術、酶解法等［5-7］。雙水相萃取技術是基于液-液萃取理論，同時保持生物活性所開發的一種新型萃取分離技術。具有分離條件溫和、操作簡單、易連續操作、易保持分離物生物活性、易與其他技術集成等特點［8］。采用乙醇-硫酸銨雙水相體系與其他高聚物的雙水相萃取相比，具有價廉、低毒、分相清晰的特點，萃取相不含粘度大，難處理的聚合物，并能縮短提取時間，降低提取成本［9］。并通過超聲波法良好的提取作用與醇-鹽雙水相體系相結合，將提取分離一體化［10］。

本實驗在建立乙醇-硫酸銨雙水相體系的基礎上，采用超聲波集成乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取分離葡萄籽中的原花青素，運用Plackett-Burman(PB設計)［11］、最陡爬坡實驗以及利用Box-Benhnken 設計和響應面分析法(Design-expert8.0.5.0 軟件)得到雙水相萃取原花青素最佳條件。為原花青素工業化制備和葡萄籽綜合利用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

取甘肅濱河食品工業集團葡萄酒下腳料，經挑選、清洗、曬干、粉碎，得到干凈的葡萄籽。

無水乙醇、香草醛、甲醇、濃鹽酸、硫酸銨均為分析純(天津市世化工有限公司)，兒茶素為標準品(上海友思生物技術有限公司)。

粉碎機(河北黃驊新興電器廠);722 型分光光度計(上海光譜儀器有限公司);電子天平(PL203)(梅特勒-托利多上海儀器有限公司);FH3 型恒溫磁力加熱攪拌器(常州國華電器有限公司);PHS-3C酸度計(北京哈納科技有限公司);SB120DT 超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系

乙醇-硫酸銨雙水相體系參照文獻［10］，在水溶性乙醇中加入硫酸銨，利用硫酸銨的鹽析作用形成雙水相體系，通過改變乙醇與水的比例和鹽的用量可以控制雙水相體系的形成。

1.2.2 原花青素的超聲提取與雙水相分離

準確稱取2 g 葡萄籽粉末，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入一定量的乙醇和水，浸泡一段時間后，再加入一定量的(NH4)2SO4成相，超聲提取一定時間，過濾，濾液于分液漏斗中靜置分層，分別測定上相乙醇相和下相清液中原花青素的含量。

1.2.3 香草醛-鹽酸法測定原花青素的含量

標準曲線制作:測定方法參照文獻［12］，選兒茶素作為標準，分別吸取不同濃度的兒茶素標準溶液0.5 mL，加4%香草醛甲醇溶液3 mL，再加入1.5 mL 濃鹽酸，避光反應15 min。以0.5 mL 蒸餾水，4%香草醛甲醇溶液3 mL，1.5 mL 濃鹽酸為空白對照，避光反應15 min。在500 nm 處測定吸光值。以反應體系所測吸光值y 為縱坐標，兒茶素含量(mg)為橫坐標，做標準曲線，求得回歸方程為Y =6.0451X+0.0115，R2=0.9956。1.2.4 樣品中原花青素的分析

吸取4% 香草醛甲醇溶液3 mL，濃鹽酸1. 5 mL，加入萃取樣品液0.5 mL(若濃度較大，可以進行適當倍數的稀釋)，避光反應15 min，在500 nm 處測定吸光值。將吸光度代入回歸方程計算原花青素濃度，按下式計算出原花青素的提取率Y 和雙水相體系的分配系數K。

式中:原花青素提取物質量是指雙水相體系中上相原花青素質量(C上V上)。C上和C下是指雙水相體系中上相和下相原花青素的濃度。

1.3 試驗設計

1.3.1 Plackett-Burman( PB) 實驗設計

根據雙水相萃取所需要的條件，選擇了可能影響葡萄籽原花青素提取的6 個因素:乙醇質量分數，硫酸銨質量分數、料液比、提取溫度、超聲時間、pH;為對6 個因素全面考察，采用試驗次數n =12 的Plackett-Burman 設計，每個因素取高低兩個水平，設計情況見表1。

表1 Plackett-Burman 實驗因素水平范圍Table 1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

1.3.2 最陡爬坡實驗

根據Plackett-Burman(PB)實驗設計找出顯著因素后，安排最陡爬坡試驗，要先逼近最佳區域后再建立有效地響應面擬合方程。最陡爬坡法試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速，經濟地逼近最佳區域。可以了解實驗因素隨試驗指標影響的規律性，即每個因素的水平改變時，指標是怎樣變化的，找出響應面因素水平的中心點。

1.3.3 Box-Benhnken Design( BBD) 實驗設計

以最陡爬坡實驗得出的顯著因素的較優作為中心點，每個因素在中心點上下適當范圍內再取兩個水平組合為在最大響應區研究提取原花青素的關鍵因素，依據Box-Benhnken 實驗設計原理進行響應面設計。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman 法篩選影響原花青素提取的主要因素

按照6 因素、n =12 次的Plackett-Burman 實驗設計表進行12 次實驗，實驗設計及結果見表2，效應評價

見表3。一般認為影響值比較大的因素對系統的貢獻較大，從表3 可以看出，所考察的六個因素對原花青素提取率的影響順序依次為X2＞X5＞X1＞X4＞X6＞X3，即硫酸銨質量分數＞超聲時間＞乙醇質量分數＞超聲溫度＞pH ＞料液比，其中X3、X4、X6(料液比，超聲溫度，pH)對結果的影響不大，而X2(硫酸銨質量分數)的影響最為顯著。所以，通過Plackett-Burman 試驗設計結果可以看出，X2(硫酸銨質量分數)、X5(超聲時間)、X1(乙醇質量分數)這三個因素為顯著因素，下一步對硫酸銨質量分數、超聲時間、乙醇質量分數這三個因素進行最優化的考察，而對X3(料液比)、X4(超聲溫度)、X6(pH)三個因素不做太多考慮，根據表3 的結果，正效應選高水平，負效應選低水平。下一步通過最陡爬坡試驗逼近提取條件的最佳區域。

表2 Plackett-Burman 試驗設計及結果(n=12)Table 2 Plackett-Burman design matrix and corresponding results (n=12)

表3 Plackett-Burman 試驗因素水平及其效應評價Table 3 Levels and effects of six factors after Plackett-Burman design optimization

2.2 最陡爬坡試驗確定響應面因素水平的中心點

因為響應面二次擬合方程在考察的緊接鄰域里才充分近似真實情形，所以應先使得顯著因素的水平盡量逼近最佳提取條件，再建立有效的擬合方程，最陡爬坡試驗正好滿足這一需求。

根據Plackett-Burman 主效應分析，在最陡爬坡試驗中對A(乙醇質量分數)、B(硫酸銨質量分數)、C(超聲時間)3 因素的變化方向，步長作了相應的設計，具體取值和試驗結果見表4。從表4 數據可知，原花青素萃取率隨關鍵因素的改變而變化，萃取率最高的為第6 組，說明該組實驗的乙醇質量分數、硫酸銨質量分數、料液比接近最優。故選第6 組為中心水平進行后續的響應面優化設計。

2.3 Box-Benhnken 設計顯著因素的最優水平

依據最陡爬坡試驗設計結果確定因素與水平，利用Box-Benhnken 設計對試驗提取條件進行了3因素3 水平的響應面分析優化，各因素和水平見表5。運用Design-expert8.0.5.0軟件進行Box-Benhnken 試驗設計的實驗設計情況及結果見表6。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Design and results of steepest ascent test

表5 Box-Benhnken 試驗因素及水平Table 5 Factors and levels in the Box-Benhnken experimental design

表6 Box-Benhnken 試驗設計及結果Table 6 The experimental design and results for response surface analysis

12 0 1 1 8.6 23 13 0 0 0 11.1 30.1 14 0 0 0 11 29.1 15 0 0 0 11.3 29.7 16 0 0 0 10.9 29.4 17 0 0 0 10 28.9

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

運用Design-expert 軟件進行二次回歸擬合后，得到以下回歸方程:Y =29.54-0.9625A-0.4875B +0. 6C-0. 025AB + 0. 05AC + 0. 2BC-4. 9825A2-3.0825B2-3.1575C2

p-Prob ＞F 值小于0.05，則表明該模型或考察的因素有顯著影響，p-Prob ＞F 值小于0.01 則表明影響極為顯著。由方差分析表7 可知，模型p-Prob＞F 值小于0.0001，則說明本實驗所選模型極為顯著。模型失擬項(lack of fit)的p-Prob ＞F 值為0.1141，大于0.05，模型失擬項不顯著，說明該模型選擇比較合理。乙醇質量分數A(p-Prob ＞F =0.0108)，乙醇質量分數二次項A2(p-Prob ＞F ＜0.0001)，硫酸銨量分數二次項B2(p-值Prob ＞F ＜0.0001)，超聲時間二次項C2(p-值Prob ＞F ＜0.0001)，這說明這些因素對模型顯著，該方程對實驗擬合情況較好。模型決定系數R2為98.04%，表明這3 個因素對原花青素提取率的影響占98.04%，而其他因素的影響和誤差占1.96%，該模型的相關度很好，與實際情況擬合良好，此模型可以用于原花青素提取條件的分析和預測。

表7 Box-Benhnken Design 回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance of the fitted regression model

2.3.2 響應面交互作用分析與顯著因素最佳值的確定

采用Design-expert8.0.5.0 軟件繪制了因素之間的等高線圖。從圖1 中可以看出，圖中等高線均呈圓形，則表明AB、AC、BC 交互作用不顯著。

通過圖1 中的等高線圖可以看出，當各因素從四周逐漸趨向于中心點時，等高線圖中提取率逐漸增加，則說明各因素的值越靠近中心點時，葡萄籽原花青素的提取率越大，響應值存在最大值，進而說明最陡爬坡試驗的中心點取值較合理，回歸模型顯著。通過Design-expert 軟件分析計算得出，當預測的響應值最大時，三個因素的最佳值為:A-乙醇質量分數21.45%，B-硫酸銨質量數23. 46%，C-超聲時間45.46 min，預測提取率最大值為29.6%。

圖1 因素之間的等高線圖Fig.1 Different effects of Contour

2.3.3 驗證試驗

為了驗證建立的模型與實驗結果是否相符，根據以上實驗中的結果確定的最佳條件進行了3 組驗證試驗，得到的平均提取率為30.1%，這與預測值29.6%相接近，證明擬合模型能較好的反映原花青素的最佳提取條件。并且與優化前(優化前條件:乙醇質量分數19%、硫酸銨質量數20%、超聲時間20 min)提取率相比提高了6 倍。

優化后葡萄籽原花青素的最佳提取條件為:A-乙醇質量分數21.45%，B-硫酸銨質量數23.46%，C-超聲時間45.46 min。此時，提取率為30.1%，分配系數為11.5。

2.3.4 雙水相體系總質量為1000 g 的放大實驗

在2 L 燒杯中加入214.5 g 無水乙醇，234.6 g硫酸銨，1∶7 料液比加入葡萄籽粉末，加水至1000 g，50 ℃溫度下超聲提取45.46 min，分液漏斗分相，取上相，經過三次平行放大實驗原花青素提取率為30.23%。

3 結論

利用Plackett-Burman 實驗、最陡爬坡實驗和Box-Behnken 實驗進行原花青素提取條件的優化，證實乙醇

質量分數、硫酸銨質量分數和料液比對原花青素提取率有顯著影響。優化后葡萄籽原花青素的最佳提取條件為:按乙醇質量分數21.45%，硫酸銨質量分數23.46%配制雙水相，料液比1∶7，50 ℃溫度下超聲提取45. 46 min，原花青素的提取率可達30.23%，分配系數為11.5。

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