蠶蛹復合氨基酸對人肝癌細胞SMMC-7721 的抑制作用

湛孝東，施自倫，李朝品，*

1皖南醫學院，蕪湖241002;2 安徽理工大學醫學院，淮南232001

蠶蛹營養豐富，蛋白質含量高，占鮮蛹的14%～15%，占干蛹的59.9%～66.2%［1］。蠶蛹蛋白水解后得到的復合氨基酸(CAASCP)含有人體生長發育所需的18 種氨基酸，其中8 種人體必需氨基酸含量高，用途十分廣泛［2］。現代藥理學研究表明，蠶蛹復合氨基酸具有提高免疫機能作用［3］、減少脂肪合成［4］、保護肝臟作用［5］、營養保健促進創口愈合作用［6，7］及抗氧化和降血壓作用［8］，但蠶蛹復合氨基酸抗腫瘤作用報道極少。有研究表明蠶蛹復合氨基酸對S180、HepA 荷瘤小鼠的瘤體有明顯的抑制作用［9］。

肝細胞癌為常見腫瘤，死亡率高，生存期短，多數患者就診時已進入晚期，不宜手術切除。探討有效的藥物治療手段十分必要。腫瘤的發生發展都與細胞凋亡密切相關，誘導細胞凋亡已成為治療腫瘤的熱點和關鍵。本實驗選用人肝癌細胞SMMC-7721，觀察蠶蛹復合氨基酸對其抑制作用及在體外誘導人肝癌細胞株HepG2 凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶蛹復合氨基酸(由湖州新天絲生物技術有限公司提供);人正常肝細胞株QSG-7701(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心);人肝癌SMMC-7721 細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心);RPMI-1640 培養液(上海鈺森生物技術有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物公司);噻唑藍(MTT)、Annexin V-FITC、碘化吡啶(PI)、Hoechst33258、二甲基亞砜(DMSO)、Triton X-100、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、RNA 酶(均購自Sigma 公司)。

1.2 儀器

IX71FL 研究級倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);Eipcs XL 型流式細胞儀(美國Bec km an-Coulter 公司);Anthos lucy2 酶標儀(奧地利ANTHOS 公司);MCO-15AC CO2培養箱(日本三洋電子有限公司);高速冷凍離心機(德國Eppendorf 公司);SW-CJ-2A 凈化工作臺(吳江市新長城空調凈化有限公司);ZD-9556 搖床(金壇市盛藍儀器制造有限公司);AE-20 電子分析天平(瑞士Metller 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 蠶蛹復合氨基酸對正常肝細胞株的藥物毒性實驗

取適量凍存人正常肝細胞QSG-7701 復蘇，放于25 cm2細胞培養瓶中，加入RPMI-1640 培養液(含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)，在37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養箱中培養、傳代。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況。每隔3d 傳代一次，傳至5 代后消化、收集對數生長期的QSG-7701 細胞，并調整濃度為4 ×104個/mL 的單細胞懸液，接種于96 孔培養板，每孔100 μL，37 ℃培養24 h 待細胞貼壁后，吸棄細胞培養液，加入不同濃度蠶蛹復合氨基酸(100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001 mg/mL)的RPMI-1640 培養液，同時設立空白對照組(只加培養液)，細胞對照組(只加細胞和培養液)，每組設5 個復孔，培養48 h 后，每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL 繼續培養4 h，吸棄上清液，150 μL/孔加入DMSO 溶液，室溫震蕩10 min。用酶標儀測量吸光度(OD 值)，檢測波長為490 nm。計算細胞存活率和最大無毒濃度TC0。一般認為在藥物作用下若細胞存活率＞95%，此藥物濃度即為TC0，對培養細胞無毒性，為藥物作用的安全濃度［9］。

1.3.2 蠶蛹復合氨基酸對人肝癌細胞株SMMC-7721 的抑制作用

1.3.2.1 蠶蛹復合氨基酸對SMMC-7721 增殖的影響

按照藥物毒性實驗中的方法將人肝癌細胞株SMMC-7721 復蘇，實驗組加入不同濃度蠶蛹復合氨基酸，分別培養24、48、72 h 后檢測OD 值。計算細胞抑制率和半數抑制濃度(IC50)。

1.3.2.2 細胞凋亡率檢測

將潔凈蓋玻片置于6 孔板內，每孔接種5 ×105個/mL 的SMMC-7721 細胞懸液1 mL，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，使蓋玻片上鋪滿細胞達80%以上。實驗分組:對照組(給予RPMI-1640 培養液);不同氨基酸濃度組。分別加入2 mL，繼續培養48 h。棄上清液，以冷PBS(pH 7.2)洗3 遍，用0.5 mL 甲醇/冰乙酸(3∶1)在4 ℃固定5 min，吸棄固定液后，以PBS 洗3 遍，室溫干燥后用Hoechst33258(10 mg/L)染色，室溫避光30 min，PBS 清洗，干燥，封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照后計算細胞的凋亡率。同一處理組隨機選擇5 個觀察視野，每個視野計數100 個細胞，計數凋亡細胞數，并計算細胞凋亡率，取5 次結果的平均值。熒光顯微鏡下正常細胞核呈彌散均勻的熒光，凋亡細胞核呈團狀或碎塊狀致密濃染的強熒光。

1.3.2.3 流式細胞術測定蠶蛹復合氨基酸對肝癌細胞周期的影響

按細胞凋亡檢測的方法加藥培養、洗滌SMMC-7721 細胞后，離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4 ℃固定保存過夜。離心棄去固定液，3 mL PBS 重懸5 min。300 目的篩網過濾1 次，500～1000 rpm 離心5 min，棄去PBS。用0.5 mL PI 染液染色，室溫避光染色30 min。流式細胞術檢測細胞周期。

1.3.2.4 流式細胞術測定細胞凋亡

按細胞凋亡檢測的方法加藥培養、洗滌SMMC-7721 細胞后，用1 ×Binding Buffer 重懸，將細胞濃度調整為1 ×106個/mL。取500 μL 細胞懸液于EP管中。加入5 μL AnnexinV-FITC 和10 μL PI，室溫下避光孵育30 min，1 h 內上流式細胞儀檢測。

1.4 統計學方法

應用SPSS11.5 統計軟件進行數據處理，數據采用均數和標準差來描述。兩樣本均數比較采用方差檢驗，選擇P ＜0.05 作為具有顯著性差異的標準。IC50通過SPSS11.5 統計軟件算出。

2 結果

2.1 蠶蛹復合氨基酸對正常肝細胞株QSG-7701的藥物毒性實驗結果

不同濃度的蠶蛹復合氨基酸對正常肝細胞株QSG-7701 的毒性作用見表1。

表1 蠶蛹復合氨基酸對正常肝細胞株QSG-7701 的毒性作用Table 1 Cytotoxicity of CAASCP against QSG-7701 cell strain

從表1 可以看出，當蠶蛹復合氨基酸的濃度為10 mg/mL 時，細胞存活率＞95%，即TC0=10 mg/mL，可以認為蠶蛹復合氨基酸在此濃度下對正常肝細胞株QSG-7701 基本無毒性。因此實驗中蠶蛹復合氨基酸的濃度分別設為10、1、0.1、0. 01、0. 001 mg/mL。

2.2 MTT 法檢測蠶蛹復合氨基酸對SMMC-7721 增殖的影響

不同濃度蠶蛹復合氨基酸分別作用24 、48 、72 h 后對SMMC-7721 增殖的抑制率見表2。

表2 不同濃度蠶蛹復合氨基酸分別作用24 h、48 h、72 h 后對SMMC-7721 增殖的抑制率(%，±s)Table 2 Inhibition rates of SMMC-7721 cell strain with different concentrations of CAASCP after 24 h，48 h，72 h culturing (%，±s)

表2 不同濃度蠶蛹復合氨基酸分別作用24 h、48 h、72 h 后對SMMC-7721 增殖的抑制率(%，±s)Table 2 Inhibition rates of SMMC-7721 cell strain with different concentrations of CAASCP after 24 h，48 h，72 h culturing (%，±s)

注:與對照組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compare with cell group，* P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01.

組別Group劑量Concentration(mg/mL)24 h 48 h 72 h OD 值OD values抑制率Inhibition rates OD 值OD values抑制率Inhibition rates OD 值OD values抑制率Inhibition rates空白對照(Blank group - 0.102 ±0.011 - 0.105 ±0.059 - 0.107 ±0.011 -細胞對照(Cell group) - 0.569 ±0.044 - 1.087 ±0.048 - 1.205 ±0.034 -藥物組Drug group 0.001 0.527 ±0.021 9.0 0.965 ±0.031＊＊ 12.4 1.021 ±0.032＊＊ 16.8 0.01 0.504 ±0.018* 13.9 0.916 ±0.057＊＊ 17.4 0.945 ±0.032＊＊ 23.7 0.1 0.468 ±0.023＊＊ 21.6 0.799 ±0.034＊＊ 29.3 0.804 ±0.022＊＊ 36.5 1 0.357 ±0.030＊＊ 45.4 0.594 ±0.025＊＊ 50.2 0.562 ±0.044＊＊ 58.6 10 0.319 ±0.039＊＊ 53.5 0.464 ±0.031＊＊ 63.4 0.432 ±0.025＊＊70.4

由表2 可得出，不同濃度的蠶蛹復合氨基酸(10、1、0.1、0.01、0.001 mg/mL)作用SMMC-7721細胞24、48 h 和72 h 后，各用藥組的細胞生長抑制率分 別 為9. 0%～53. 5%、12. 4%～63. 4% 和16.8%～70.4%。蠶蛹蛋白復合氨基酸對SMMC-7721 細胞有較強的抑制作用，各組與細胞對照組相比，吸光度值的差異有顯著性(P ＜0.05)，同時顯示出對劑量和時間的依賴性，即在同一作用時間內，藥物濃度增加，細胞生長抑制率增加;同一藥物濃度下，作用時間越長，細胞生長抑制率越高。作用24、48、72 h 后，蠶蛹蛋白復合氨基酸對SMMC-7721 細胞的IC50分別為4.691、1.469 和0.451 mg/mL。

2.3 細胞凋亡率檢測結果

不同濃度蠶蛹蛋白復合氨基酸作用SMMC-7721 細胞48 h，經Hoechst33258 染色法對其進行染色后，熒光顯微鏡下觀察，結果見圖1。在熒光顯微鏡下，活細胞核呈彌散、均勻熒光，壞死細胞不被Hoechst 染色。出現細胞凋亡時，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀藍色熒光及明顯核形態變化，如果見到3 個或3 個以上的DNA 熒光碎片被認為是凋亡細胞。不同濃度蠶蛹蛋白復合氨基酸作用48 h 后SMMC-7721 細胞的凋亡率見表3。

圖1 不同濃度蠶蛹蛋白復合氨基酸作用SMMC-7721 后的染色結果Fig.1 Dyeing results of SMMC-7721 with different concentrations of CAASCP

表3 不同濃度蠶蛹蛋白復合氨基酸作用48 h 后SMMC-7721 細胞的凋亡率Table 3 Apoptosis rate of SMMC-7721 with different concentrations of CAASCP after 48 h culturing

正常對照組細胞凋亡率為2.33%;0.001 mg/mL 濃度組的細胞凋亡率為3.32%;0.01 mg/mL 濃度組的細胞凋亡率為6.73%;0.1 mg/mL 濃度組的細胞凋亡率為13.66%;1 mg/mL 濃度組的細胞凋亡率為22.89%;10 mg/mL 濃度組的細胞凋亡率為31.21%。隨著蠶蛹蛋白復合氨基酸濃度的不斷增大，細胞凋亡率亦不斷增大，且與細胞對照組相比，差異有顯著性。

2.4 蠶蛹蛋白復合氨基酸作用后SMMC-7721 細胞的周期變化

經PI 染色后，利用流式細胞術檢測蠶蛹蛋白復合氨基酸對肝癌細胞SMMC-7721 的細胞周期分布的影響，結果見表4。

表4 蠶蛹蛋白復合氨基酸對人肝癌SMMC-7721 細胞周期分布的影響Table 4 Effect of CAASCP on cell cycle distribution of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cell strain

由表4 可得出，正常生長的細胞對照組G0/G1期、S 期和G2/M 期細胞所占比例分別為48. 6%、42.3%和9.1%。不同濃度蠶蛹蛋白復合氨基酸作用SMMC-7721 細胞48 h 后，各給藥組G0/G1期和S期細胞所占比例出現不同程度的降低，而G2/M 期細胞則出現不同程度的升高，其中以10 mg/mL 濃度組升高的最多，為42.1%。實驗表明蠶蛹蛋白復合氨基酸能夠將人肝癌細胞株SMMC-7721 細胞阻滯在細胞的G2/M 期，并能誘導其凋亡。

2.5 蠶蛹蛋白復合氨基酸作用后SMMC-7721 細胞的凋亡變化

不同濃度蠶蛹蛋白復合氨基酸作用SMMC-7721 細胞48 h 后，檢測細胞凋亡情況。用FlowJo 5.0 軟件分析流式細胞儀檢測的圖像，其中第一象限為壞死細胞，第二象限為晚期凋亡細胞，第三象限為活細胞，第四象限為早期凋亡細胞。結果見圖2。不同濃度蠶蛹蛋白復合氨基酸作用SMMC-7721 細胞后的細胞凋亡和壞死率的變化見表5。

由圖2、表5 可見，細胞對照組的凋亡和壞死細胞占7%，0.001 mg/mL 濃度組的凋亡和壞死細胞占11.75%，0.01 mg/mL 濃度組的凋亡和壞死細胞占25.84%，0.1 mg/mL 濃度組的凋亡和壞死細胞占38.17%，1 mg/mL 濃度組的凋亡和壞死細胞占47.90%，10 mg/mL 濃度組的凋亡和壞死細胞占51.63%。隨著蠶蛹蛋白復合氨基酸濃度的增加，凋亡和壞死細胞占的比率也增大，呈現一定的劑量依賴性。結果表明，蠶蛹復合氨基酸在體外能夠明顯的促進SMMC-7721 細胞株的凋亡和壞死。

3 討論

本實驗選取正常肝臟細胞QSG-7701 為對照細胞，通過藥物毒性實驗篩選出對正常肝臟細胞基本無毒的蠶蛹蛋白復合氨基酸的濃度，用此濃度的蠶蛹蛋白復合氨基酸去體外作用于肝癌細胞SMMC-7721，以此來研究其在體外的抗肝癌細胞的作用。蠶蛹復合氨基酸在濃度低時對正常細胞具有營養作用，故避免了因為濃度過大而引起對正常肝臟細胞的損害，對肝癌細胞具有抑制作用的同時對正常細胞提供營養，促進其生長［10］。以上實驗表明，蠶蛹復合氨基酸對肝癌SMMC-7721 細胞株具有較強的抑制作用。

圖2 不同濃度蠶蛹蛋白復合氨基酸作用SMMC-7721 后的細胞凋亡和壞死情況Fig.2 Apoptosis images of SMMC-7721 with different concentrations of CAASCP

表5 不同濃度蠶蛹蛋白復合氨基酸作用SMMC-7721 后的細胞凋亡和壞死率的變化Table 5 The apoptosis and necrosis rates of SMMC-7721 cell strain with different concentrations of CAASCP

流式細胞儀是目前國際公認的最客觀的凋亡檢測指標之一，尤其在用于定量分析和細胞周期分析時更為有效［11］。細胞凋亡時，流式細胞檢測可呈現亞二倍體核型峰的特征，也就是說，用DNA 結合染料PI 嵌入重疊的DNA 中，流式儀檢測DNA 含量低于正常二倍體的細胞就是亞二倍體細胞，也就是凋亡細胞，因而在DNA 直方圖上凋亡細胞出現二倍體峰(G1細胞)的減少，G1峰左側出現亞二倍體細胞群的峰型(Sub-G1)［12］。在我們研究凋亡細胞周期分析發現，蠶蛹復合氨基酸能阻滯肝癌細胞SMMC-7721 的細胞周期于G2/M 期，使G2/M 期細胞比例增加，而G0/G1期和S 期細胞比例下降，說明所制備的蠶蛹復合氨基酸溶液能夠將肝癌細胞SMMC-7721 阻滯在細胞的G2/M 期，具有抑制肝癌細胞的功能并能誘導其凋亡，這與國內學者的報道一致［13］。

本研究證實了蠶蛹復合氨基酸對肝癌SMMC-7721 細胞株具有一定的抑制作用，為蠶蛹復合氨基酸的藥效提供了理論支持，也為蠶蛹的綜合利用開辟了新途徑。但本研究只是在體外觀察了蠶蛹蛋白復合氨基酸對肝癌SMMC-7721 細胞株的抑制作用，還需體內實驗的驗證。另外蠶蛹蛋白復合氨基酸的成分復雜，具體的抗癌成分也有待進一步分析。

1 Tomotake H，Katagiri M，Yamato M.Silkworm pupae (Bombyx mori )are new sources of high quality protein and lipid.J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo)，2010，56:446-448.

2 Wang YP(王彥平)，Liu J (劉潔)，Wu YM (吳予明)，et al. Analysis of nutrition composition on silkworm pupa. J Zhengzhou Univ (Med sci)，2009，44:638-641.

3 Chang YQ(昌友權)，Qi YX(戚穎欣)，Sun XW(孫學偉)，et al.Research on effects of protein in silkworm chrysalis on immunological function of mice. Food Sci，2007，28:520-522.

4 Lee SH，Park D，Yang G，et al.Silk and silkworm pupa peptides suppress adipogenesis in preadipocytes and fat accumulation in rats fed a high-fat diet.Eur J Nutr，2012，51:1011-1019.

5 Deng LX(鄧連霞)，Shen XQ(沈新琦)，Zhu LY(朱良均)，et al. New research on application of silkworm pupa. Bull Sericulture，2011，41(3):10-13.

6 Pu JB(浦錦寶)，Zhu YQ(祝永強)，Zheng JX(鄭軍獻)，et al.Nourishing and concreting effects of co-amino acids extracted from silkworm chrysalis on surgical hurt rats. Chin J Clin Pharmacol Ther，2004，9:811-814.

7 Pu JB(浦錦寶)，Ji CL(季春蓮)，Wei LX(魏凌秀)，et al.The impact of co-amino acids extracted from silkworm chrysalis on the growth of juvenile male rats. Chin J Trad Medi Scie and Tech，2001，(8):371-372.

8 Zhao ZX(趙鐘興)，Liao DK(廖丹葵)，Sun JH(孫建華)，et al. Screening for optimal enzyme for preparation of silkworm pupae protein hydrolysate with in vitro antixodiant and antihypertensive activities and process optimization by response surface methodology.Food Sci，2011，32:186-191.

9 Lou JX(樓錦新). The pupa composite amino acids in the treatment of malignant tumors. Chin J Cancer，1995，4(5):29-29.

10 Pan XB，Zhu L，Gao Y，et al.Comparisons of the characteristics and mechanisms of HBV replication in QSG-7701 and HepG2 cell lines. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2007，15(2):83-87.

11 Chang Q，Hedley D.Emerging applications of flow cytometry in solid tumor biology.Methods，2012 Apr 6.(Epub ahead of print).

12 Lindstr?m S. Flow cytometry and microscopy as means of studying single cells:a short introductional overview.Methods Mol Biol，2012，853:13-15.

13 Hu DC(胡德聰)，Liu Q(劉瓊)，Wang H(王紅)，et al.Apoptosis of human hepatoma cells SMMC-7721 induced by selenium-abundant amino acids from silkworm pupa. Chin Pharmacol Bull，2004，20:1287-1292.