針刺對兔膝骨性關節炎軟骨TGF－β1、TNFα的影響作用＊

繆輝宇 萬 雷 陳 宇 廣州中醫藥大學附屬骨傷科醫院（廣州510240）

骨性關節炎（OA）是一種慢性關節疾患，表現為關節內軟骨退化以及損害后關節內骨的增生、變形導致關節功能改變甚至功能喪失。我國患膝關節骨性關節炎的人數占總人口約3%，其中55歲以上人群在X線上有膝關節骨性關節炎表現者約占6%，65歲以上老年人膝關節骨性關節炎發病率高達85%［1，2］。目前該病的治療尚未取得突破性進展，防治OA 已成為當今國際上的研究熱點。現有西醫治療多以非甾體類抗炎藥緩解癥狀為主，但長期使用后胃腸道毒副作用明顯，常使患者不能耐受而終止治療。相對而言，針刺療法具有簡便價廉且適合長期使用的特點，故越來越引起了醫學界的關注。針刺療法在治療OA方面的確切療效已被臨床實踐所驗證。研究發現，導致OA 關節破壞的主要原因是軟骨合成和分解代謝的失衡［3，4］，這種失衡很大程度在于病變關節部位細胞因子的異常活動，其中轉化生長因子（TGF－β1）和腫瘤壞死因子（TNFα）參與軟骨細胞的生長、分化，和軟骨代謝關系最為密切。為了探索針刺防治OA 的分子細胞學機制，本課題引入TGF－β1、TNFα細胞因子，利用現代分子生物學技術研究針刺對TGFβ1、TNFα的影響，探討針刺防治OA的作用機理。

1 材料與方法 1.1 動物 新西蘭大白兔30只，體重2.5～3.0Kg，雄性，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供。所有大白兔均飼養于恒溫恒濕的清潔環境中，環境溫度為（25±1）℃，濕度70%，每天12h光照／黑暗，任意進食飼養者提供的大白兔標準飼料和自來水。

2 實驗方法 2.1 分組與造模 將新西蘭大白兔30只隨機分為2組，即造模組27只，正常組3只。正常組不予任何處理，造模組用戊巴比妥鈉（30mg／kg）靜脈注射麻醉，消毒膝關節皮膚，將4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.3mL通過髕上韌帶兩側注入兔膝關節腔，每3d1次，連續注射3次。術后持續1周肌注青霉素20萬U／d以預防感染。動物常規飼養，木瓜蛋白酶末次注入后第2天，以空氣栓塞法處死C組動物，解剖左膝關節，于脛骨平臺處切取關節軟骨組織，觀察關節軟骨形態變化，評估造模是否成功。

2.2 干預方法 造模成功后再隨機分3組，即模型組，針刺組，西樂葆組，每組8只。模型組不作任何處理，針刺組行針刺治療，西樂葆組予西樂葆灌胃給藥。

西樂葆組動物按24mg／d／只灌服西樂葆，每天1次，連續灌胃36d。

針刺組：取穴“內外膝眼”、“鶴頂”、“梁丘”、“血海”、“足三里”，備皮，穴位局部常規消毒，以毫針進行針刺，行提插捻轉、平補平瀉手法。留針20min，每隔5min捻針1次。每天1次，10次為1個療程，療程間休息3d，再行下1個療程，共針刺3個療程。

實驗結束時，處死全部新西蘭兔，取左膝股骨內側髁關節軟骨和關節液進行觀察和檢測。

2.3 指標檢測 2.3.1 關節軟骨組織的形態學觀察 取股骨內側髁關節軟骨，用10%中性多聚甲醛溶液固定24h后，EDTA脫鈣4～8w。HE染色：脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，展片，染色。觀察軟骨層的完整性、軟骨細胞的分布及數量、潮線及軟骨下骨的改變。進行Mankin評分（1～5分為早期，6～9分中期，10～14分為晚期）［5］，驗證造模成功。

2.3.2 關節液的抽取檢測 關節液的抽取：兔膝部毛剔干凈，用2.5mL一次性無菌注射進行膝關節穿刺，注入無菌生理鹽水1mL，反復抽吸、注入3～5次，使沖洗液混勻，最后盡量抽盡膝關節腔內液體。將抽取的關節液3000r／min 離心20min，收集上清液，最后得關節液0.5mL／膝，置于－20℃低溫冰箱保待檢采用ELISA法檢測關節液中TGF－β1和TNF－α的水平，具體步驟按試劑盒說明書進行。

2.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計學軟件進行統計分析，數據用（±s）表示，采用方差分析，組間比較采用兩樣本t檢驗。

3 結 果 3.1 實驗動物數量分析 實驗共納入30只白兔，其中6只用于膝關節骨性關節炎模型驗證，最后24只進入結果分析，無脫落，見表1。

3.2 各組關節軟骨組織形態學Mankin′s評分 Mankin′s評分結果顯示，模型組Mankin′s評分較正常組明顯升高（P＜0.01），說明造模成功。針刺組和西樂葆組Mankin′s評分均較模型組低（P＜0.01），但兩組間差異無顯著性意義（P＞0.05），見表2。

表1 兩組關節軟骨組織形態學Mankin′s評分結果

表2 造模后三組關節軟骨組織形態學Mankin′s評分結果

3.3 三組兔膝關節液中TGF－β1和TNF－α的水平比較 見表3 兔膝骨性關節炎發生后，關節液中TNF－α的水平明顯增高（P＜0.01），TGF－β1水平明顯降低。針刺和西樂葆治療后關節液中TNF－α水平較模型組顯著降低（P＜0.01），兩組間比較差異無顯著性意義（P＞0.05）；而TGF－β1水平較模型組明顯升高（P＜0.01），且兩組間比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。

表3 三組兔膝關節液中TGF－β1和TNF－α的水平比較

4 討 論 膝骨關節炎是一種多發于中老年人的慢性退行性疾病，其主要病理特征是膝關節軟骨中細胞數目的減少和軟骨基質的降解。隨著分子生物學的發展，細胞因子在OA中的作用越來越受到人們的關注。細胞生長因子是一組具有促進細胞生長增殖和合成的蛋白質或多肽對骨和軟骨的形成與修復起局部調節作用。其中TGF－β1表現出多重生物學特性，是各種生長因子中促進軟骨細胞增殖最有效的生長因子，對修復軟骨損傷具有重要作用。在牛軟骨細胞的培養中，TGF－β1加快了蛋白多糖的代謝，并刺激膠原和葡糖胺聚糖在兔關節軟骨中的合成，降低細胞外基質成分的降解［5］。Aral等［6］用腺病毒介導將TGF－β1基因成功地轉入人軟骨樣細胞株HCS－2／8，顯著增加了軟骨特異性Ⅱ型膠原和蛋白多糖核心蛋白的表達，并抑制基質金屬蛋白酶23表達，說明TGF－β1可刺激軟骨細胞增生，促進糖蛋白轉化，增加軟骨基質的合成，拮抗炎癥因子，從而有利于軟骨修復。有實驗顯示，TGF－β1不足可能是OA 的致病的重要因素之一［7］。不過，也有資料表明TGF－β1對軟骨細胞可能具有雙向調節作用［8］，一方面，它能促進未分化的和分化早期的軟骨細胞DNA復制，促進軟骨細胞增殖并促進蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成；另一方面，對分化末期的軟骨細胞，TGF－β1則抑制其分化并抑制軟骨基質的合成和鈣化。

TNF－α是一種多功能炎性細胞因子，主要參與激活多型核細胞，刺激滑膜細胞的前列腺素E2（prostglandins E2，PGE2）的產生，增加骨和軟骨的破壞，刺激人軟骨細胞分泌纖維蛋白溶酶激活劑，使纖維蛋白溶酶原變成纖維蛋白溶酶而加重關節炎損傷，同時，破骨細胞減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產生膠原酶和其他中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導致骨和軟骨的破壞。大量研究結果表明，TNF－α能促進成纖維細胞釋放黏附分子，激活并增強血管內皮細胞對黏附分子的表達，使血液中的白細胞通過與黏附分子相互作用被集中到關節腔參與對軟骨細胞的破壞，對于TNF－α水平增高的具體原因，多數學者認為可能主要與滑膜的炎性變有關［5］。

從本實驗結果可以看出，造模成功后，模型組Mankin′s評分、TNFα水平明顯升高（P＜0.01），而TGF－β1明顯降低（P＜0.01），說明造模成功，造模后膝關節軟骨開始退化，關節腔內促炎性細胞因子TNF－α和抗炎性細胞因子TGF－β1分泌增多。針刺和西樂葆雖然對各炎性細胞因子調節略有所差異，但總的看來，起調節趨勢是一致的，均可降低TNF－α和升高TGF－β1。骨關節炎屬中醫“痹癥”范疇，多以肝腎不足為本，氣滯血瘀為標，臨床治療應從中醫角度辨證，以補肝腎為總治則，施以辨證論治。針刺療法是一種傳統的中醫治療方法，具有簡便價廉且適合長期使用的特點，針刺療法在治療OA方面的確切療效已被臨床實踐所驗證。本研究結果再次表明，針刺特定穴位可以減少關節液中TNF－α水平，改變關節局部的內環境，對早期兔膝OA起防治作用。值得注意的是，針刺組TGF－β1水平較西樂葆組明顯升高（P＜0.01），提示針刺不僅可降低受損關節局部炎癥，更可以促進機體細胞生長因子的分泌，從而加速受損軟骨修復，顯示針刺具有良好的雙向調節作用。總之，實驗結果顯示早期采用針刺特定穴位，能降低關節液TNF－α水平和升高TGF－β1水平，減輕關節軟骨退行性變。因此，調控關節軟骨細胞因子是針刺防治早期兔膝OA的作用機制之一。

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