源于中間偃麥草的抗條銹基因YrCH223的遺傳分析及SSR定位

劉 潔，暢志堅，李 欣，張曉軍，詹海仙

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院作物科學研究所，山西太原030032）

小麥條銹病是由條銹菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）引起的全球性小麥病害之一，歷史上曾多次流行成災，嚴重為害我國小麥的安全生產[1-2]。實踐證明，篩選和培育抗病品種是防治小麥條銹病最為經濟、安全和有效的方法，而優異的小麥條銹病抗源及抗病基因是抗病育種的基礎[3]。雖然國際上已經正式命名了45個位點的52個小麥抗條銹病基因（Yr1～Yr49）[4-5]，但其中大多數抗病基因具有生理?；裕@些抗病基因往往因病菌小種的變異而很快“喪失”抗性。特別是2002年以來，條銹菌條中32號（CYR32）、條中33號（CYR33）小種成為我國當前最主要的流行毒性小種后，只有為數不多的幾個抗病基因Yr5，Yr10，Yr15，Yr24，Yr26 和Yr41 等仍保持抗性，大多數抗病基因都“喪失”了抗性[3，6]?？共』虻膯我换筒≡拘宰儺悓е铝送茝V品種不斷“喪失”抗病性，從而造成病害的大流行。針對小麥生產品種的抗銹性“喪失”問題，人們曾提出了各種不同的解決辦法，如基因輪換、基因合理布局、培育多系品種、抗病基因組成復雜化、持久抗病性利用等，但最終都離不開對抗條銹新基因的挖掘和利用[7]。因此，挖掘不同類型的抗病基因，并開發其緊密連鎖的分子標記，對于拓寬小麥抗源的遺傳基礎、加速抗病育種進程、逐步實現我國小麥條銹病的可持續控制具有十分重要的意義。

小麥的野生近緣植物是小麥寶貴的基因資源庫，從小麥的近緣種屬導入抗病新基因是實現小麥抗源多樣化、解決抗病性喪失的有效途徑[8]。中間偃麥草（Thiuopyrum iutermedium，2n＝6x＝42，JJSS）是在小麥遺傳改良中利用較為廣泛的一個小麥野生近緣植物，它具有多花、多實、優質、耐鹽堿、抗旱、抗多種病害等優良特性[9]，而且其J/JS組染色體與小麥具有一定的同源性，易與小麥同源染色體發生重組[10]，許多育種學家已聚焦其特性的利用，現已將其對小麥銹病、黃矮病和根腐病的抗性基因成功地導入小麥，育成品種且大面積推廣[11]。而抗條銹病基因的鑒定及利用鮮有報道。CH223是山西省農業科學院暢志堅研究員以普通小麥與中間偃麥草雜交獲得的八倍體小偃麥新類型——TAI7047為抗源，通過J/JS組染色體與小麥染色體之間的異源重組，向普通小麥導入偃麥草的抗病基因而育成的兼抗小麥條銹病、白粉病的抗病新種質[12-13]。本試驗進一步研究了CH223新抗源中抗條銹病基因的來源、抗性遺傳方式，并對抗性基因進行了染色體定位。這對該抗病基因的有效利用、拓寬小麥遺傳資源具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

CH223為源于晉麥33/TAI7047//京411///京411的BC2F6世代的小偃麥高代品系，由山西省農業科學院作物科學研究所分子標記實驗室育成。系譜中的TAI7047為來自中間偃麥草（Z1141）的八倍體小偃麥，晉麥33和京411均為感病的小麥品種。TAI7047選自雜交組合太原768/Z1141//晉春5號[14]，由中國科學院遺傳與發育研究所李振聲院士選育、鐘冠昌研究員提供，其野生親本中間偃麥草由山西省農業科學院作物科學研究所孫善澄研究員提供。

用于抗性遺傳分析的材料有：CH223，感病品種臺長29，SY95-71及其雜種F1，F2，BC1和F2∶3家系，以及用于SSR標記定位分析的中國春缺體-四體、雙端體材料，均由山西省農業科學院作物科學研究所重點實驗室提供。

抗性鑒定所用條銹菌系（小種）CYR32，CYR33由電子科技大學生命科學與技術學院楊足君教授提供。

1.2 苗期及成株期抗性鑒定

1.2.1 苗期抗性鑒定 2008—2009年，用國內目前毒力最強的條銹菌流行小種CYR32，CYR33對CH223及其系譜材料進行了苗期接種與抗性鑒定。鑒定材料包括：CH223，SY95-71，臺長29，中間偃麥草，TAI7047，晉麥33，京411，晉春5號，太原768以及抗病對照八倍體小偃麥中4和感病對照銘賢169。具體接種采用掃抹法，將預先繁殖好的CYR32，CYR33的新鮮菌種接種于一葉期麥苗上，并罩上用鐵絲架撐開的透明塑料布以防污染。分小種接種后的幼苗在10℃黑暗保濕24 h后，置于18℃/12℃（白天/晚上）、光照12～14 h/d、光強5 000～8 000 lx、相對濕度60%～80%的條件下培養。待感病對照品種銘賢169到發病盛期時，按0（免疫）、0；（近免疫）、1（高抗）、2（中抗）、3（中感）、4（高感）6級常規分級標準，逐株調查記載各材料的反應型，必要時輔以“＋，－”表示同級內反應型偏重或偏輕的發病類型。

1.2.2 成株期抗性鑒定 CH223成株期抗性鑒定于2009—2011年在成都市新都區四川省農業科學院基地試驗場進行。供試材料CH223和感病品種臺長29，SY95-71及其雜交、回交所獲得的F1，F2，BC1群體和F2∶3家系按以下播種方法種植于大田。雙親、F1各播1行，每行20粒，BC1點播104粒，F2點播221粒，F2∶3家系及親本種植1個重復，行長1.2 m，每行點播15粒，行距0.25 m。為確保發病充分，每10行種植1行銘賢169作感病對照，并且試驗材料四周種植綿陽11誘發材料。所用小麥條銹菌種為CYR32，待感病對照充分發病后調查記載，成株抗性評價在抽穗期進行，開花期復查一次，反應型記錄標準與苗期的相同。雙親和F1按行觀察，F2，BC1及F2∶3家系分單株調查抗感并逐一記錄，根據F1的反應型及F2，BC1群體和F2∶3家系中抗、感單株分離比例，確定控制抗性的基因對數和顯隱性，并用卡方檢驗進行分離比適合度測驗，確定CH223所含抗條銹基因的數目及互作方式。

1.3 抗病池和感病池的建立

參照SDS法[15]提取親本和F2分離群體單株幼嫩葉片總DNA，根據Michelmore等[16]介紹的集群分離分析法（bulked segregation analysis，BSA），在F2群體中選取10株抗病株和10株感病株，將其DNA分別等量混合建立F2群體的抗病池、感病池。

1.4 PCR 擴增和SSR 分析

根據R?der等[17]、Somers等[18]和GrainGenes database（http://www.wheat.pw.usda.gov）提供的微衛星引物序列，首先選取GWM，WMC，BARC，CFD，CFA和GDM系列的SSR引物581對，由北京華大基因公司合成。經過以抗病親本、感病親本、抗病池、感病池的DNA為模板初篩SSR引物之后，增補了部分以上系列和GPW系列的SSR引物。

PCR反應總體系為20μL：含有2μL 10×Buffer（10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2），0.2 mmol/L dNTP，1 U Taq 酶，0.25μmol/L引物和80～100 ng模板DNA。反應擴增程序為：94℃變性5 min；94℃變性45 s，50，55℃或60℃（因引物不同而異）復性45 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min，4℃保存備用。PCR反應在PTC-200型熱循環儀上進行。

擴增后的每個產物加入等體積的Loading Buffer（4 g/mL蔗糖；1 mg/mL溴酚蘭和1 mg/mL二甲苯青）充分混勻，每個樣品取4～6μL在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis＝29∶1）中恒定電壓150 V下電泳2 h左右，硝酸銀染色顯影。

1.5 數據分析

SSR擴增帶型數據用Mapmaker/EXP 3.0軟件分析標記與抗病基因的連鎖關系，用Kosambi mapping函數將重組值轉換為遺傳距離，用Mapdraw2.1繪制連鎖圖。

2 結果與分析

2.1 苗期條銹抗性鑒定分析

對1.2.1中所述材料接種鑒定的結果表明，CH223，TAI7047和中間偃麥草的抗性表現與抗病對照中4相同，均對小麥條銹生理小種CYR32和CYR33表現免疫或近免疫反應；而其余的小麥親本材料則對這2個生理小種表現出4級侵染型高度感病反應（表1）。由此推斷，CH223攜帶的抗條銹基因很可能來源于中間偃麥草。

表1 抗病品系CH223、八倍體小偃麥及其親本的抗條銹性鑒定結果

2.2 成株期抗條銹性遺傳分析

2009—2010年用小麥條銹菌種CYR32對抗病親本（CH223）、感病親本（臺長29和SY95-71）及這2個抗感雜交組合的雜種F1，F2，BC1和F2∶3家系等供試材料誘發鑒定，結果表明，抗病材料CH223對該高致病力菌種抗性穩定，表現為完全免疫；各雜交組合的F1單株對CYR32的反應型也為0，0；級，呈現免疫或近免疫反應，與CH223的抗性反應一致；而感病親本臺長29與SY95-71則表現為高度感病，反應型為4級，說明CH223對條中32號小種（CYR32）抗性反應受顯性基因控制。

CH223與不同感病親本的F2分離群體中，抗感分離明顯，其分離比均符合R∶S＝3∶1的1對顯性核基因的遺傳分離模式（χ2＜χ20.05，1＝3.84）。其中，CH223×臺長29雜交組合的221株F2植株中，162株抗病，59株感病，其χ2＝0.34，P＝0.56，表明抗感的分離比符合3∶1。同樣，215株來自SY95-71×CH223雜交組合F2植株中，抗病株157株，感病株58株，其抗感分離比也符合3∶1（χ2＝0.45，P＝0.50）。在鑒定的98株BC1（SY95-71/CH223//SY95-71）單株中，53株抗病，45株感病，其χ2＝0.65，P＝0.42，符合1∶1的分離比（表2）。

表2 抗×感雜交組合各世代對條中32 號小種的抗性表現及分離

2010—2011年，將CH223分別與臺長29和SY95-71雜交的2個F2群體分行種植于大田并接種了條銹菌CYR32，成株期調查F2∶3家系結果顯示，來自雜交組合CH223×臺長29的221個F2∶3家系中，抗病不發生抗性分離（YrYr）的53個，抗感分離（Yryr）的111個，感病且不分離（yryr）的57個；來自CH223×SY95-71雜交組合的215個F2∶3家系中，全抗（YrYr）的58個，抗感分離（Yryr）的113個，全感（yryr）的44個。χ2檢驗結果分別為χ2（1∶2∶1）＝0.92和χ2（1∶2∶1）＝2.39。均符合1∶2∶1的顯性單基因分離模式（表3）。

以上結果充分說明，衍生于中間偃麥草的抗病品系CH223對條銹菌CYR32菌系的成株抗性受1對顯性核基因控制。

表3 抗×感雜交組合的F2∶3株系對條中32號小種的抗性表現及分離

2.3 抗病基因分子標記篩選及定位

試驗中選取了雜交組合CH223×臺長29的F2群體用于SSR分析，該分離群體有221個單株。利用平均分布于小麥基因組各條染色體上的581對小麥SSR引物對抗感親本進行分析，其中，只有引物Xgwm540 和Xwmc47 的擴增產物在抗感親本及抗感池之間表現出一致的多態性。且經分離群體驗證，Xgwm540 和Xwmc47 均與抗病基因連鎖。

在Somers等[18]整合的小麥微衛星遺傳圖譜上，Xgwm540 和Xwmc47 同時在5B和4B染色體上均有擴增位點，為進一步明確與抗病基因連鎖的標記帶在染色體上的確切位置，實驗室又增加了一些4B與5B染色體上的SSR引物進行篩選，同時用整套21個中國春缺體-四體材料和雙端體材料進行確定。結果發現，在缺體-四體材料中，引物Xgwm540 和Xwmc47 在N4BT4A上均無相應的擴增帶型，而在N5BT5D材料上均有擴增帶型。與此同時，又篩選出引物Xwmc310在抗感親本和抗感池之間有一致的多態性，這個SSR引物只被定位于4B染色體上，因此推斷CH223的抗條銹病基因位于4B染色體上。初定位于4B染色體上之后，又選取58對位于4B上的SSR引物進行分析，發現引物Xbarc1096，Xgpw7272 在抗感親本和抗感池間也呈現出一致的多態性，經F2分離群體的221個單株驗證，這5對引物均與抗病基因緊密連鎖（圖1顯示了其中3對引物與抗病基因連鎖的多態性），其連鎖性在CH223×臺長29的F2∶3家系分析中也得到了進一步的驗證，該抗病基因命名為YrCH223。通過Mapmaker/EXP 3.0軟件分析，5對SSR標記與YrCH223 處于同一個連鎖群中，位置順序為：

Xgwm540-Xbarc1096-YrCH223-Xwmc47-Xwmc 310-Xgpw7272，遺傳距離分別為21.9，8.0，7.2，12.5，11.3cM（圖2）。標記Xgwm540，Xbarc1096，Xwmc47，Xwmc310 和Xgpw7272 呈顯性遺傳，帶型分離比符合1∶2∶1的比例。

在Somers等[18-19]發表的小麥微衛星圖上，Xgwm540，Xbarc1096，Xwmc310，Xgpw7272 和Xwmc47 都被定位在小麥4B染色體上，除Xgwm540 位于4B短臂上外，其余4個均位于4B染色體的長臂上。雖然Xgwm540 同時位于染色體5BS和4BS，Xwmc47 同時位于染色體5AS，5BS和4BL上（http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes），根據Mapmaker/EXP 3.0分析結果，推斷CH223的抗病基因位于4B上。由于部分與抗病基因連鎖的SSR引物在不同的染色體上都有擴增位點，為了進一步證實與抗病基因連鎖的標記帶是否在染色體4B上，用這5對引物在中國春、中國春缺體-四體N4BT4A和雙端體材料Dt4BL上進行擴增，結果顯示，5對SSR引物在中國春缺四體N4BT4A上均沒有擴增出相應的帶型，而雙端體材料Dt4BL中除Xgwm540 擴增出條帶外，其余4個引物也無相應擴增帶（圖3）。由此充分說明，與抗病基因連鎖的這5對SSR標記均位于4B染色體上，而且Xgwm540 位于4BS上，其余4個SSR引物位于4BL染色體上。通過Mapmaker軟件分析，結果表明，抗病基因位于Xbarc1096 和Xwmc310 之間，這2個引物都位于染色體4BL上，因此，推斷YrCH223 也位于染色體4BL上。

3 討論

3.1 抗病基因的來源

CH223是以八倍體小偃麥TAI7047為抗源，通過‘六×八’式雜交、回交選育出的高代抗病新品系?？剐澡b定結果表明，除中間偃麥草、CH223及其抗病親本TAI7047對當前流行小種CYR32，CYR33免疫外，其余小麥親本均為高感。由于TAI7047的雜交系譜為太原768/Z1141//晉春5號[13]，且其小麥親本太原768和晉春5號對上述2個條銹菌系亦為高感。由此推斷，CH223的抗條銹基因來自中間偃麥草（Z1141）。許多國內外學者利用中間偃麥草創制了異附加系、代換系、易位系的抗病材料，但未見對其抗性基因鑒定的報道。據Hu等[20]和Chang等[21]的報道，在小偃麥代換系中發現一抗條銹基因位于1St染色體上，這個代換系是中間偃麥草的1St染色體代換了小麥的1D染色體，但也未見將其抗性基因整合到小麥基因組中的進一步報道。而國際上已公布的抗條銹基因中，尚未發現有來自中間偃麥草的報道[4-5]。因此，從抗性基因的來源看，CH223所含的抗條銹基因是新基因。

3.2 抗病基因的遺傳

通過染色體易位導入外源有益基因是實現種質創新的重要途徑。但目前國內外育成的小麥-異源抗病易位系中，絕大多數往往因其遺傳補償性差、細胞學不穩定以及與不良基因的連鎖而無法直接用于小麥育種和生產[22]。而對于新抗源CH223抗性遺傳分析結果顯示，在CH223與感病的小麥品種（系）雜交、回交所獲得的F2，BC1，F2∶3雜種群體中，其抗感的分離比例分別符合3∶1，1∶1和1∶2∶1的單顯性基因分離模式。這種抗性分離方式符合孟德爾遺傳定律，說明CH223不可能含有較大的外源染色體片段，而且通過GISH實驗分析也未發現外源DNA雜交信號，所以，推斷CH223可能屬于含偃麥草抗條銹病基因的小麥-異源滲入系。因而，導入的外源抗病基因遺傳較為穩定，有利于該抗條銹新品系的培育和推廣。

3.3 抗條銹基因YrCH223 的育種價值

中間偃麥草作為小麥育種的重要資源庫，在小麥抗病育種工作中有非常大的應用潛力[14]。據報道，中間偃麥草對小麥多種病害免疫或高抗[9]，對當今條銹流行小種CYR32和CYR33也具有極強的免疫力[22-23]。而在迄今為止國際上已命名的抗條銹基因中，除Yr5，Yr10，Yr15，Yr24，Yr26和Yr41 等對當前流行小種仍保持抗性外，其余抗性基因基本都“喪失”了抗性[3，6]。并且在這幾個仍保持抗性的基因中，Yr10，Yr15，Yr24，Yr26 均被定位在小麥的1BS上，其中，Yr24 與Yr26 為同一基因[24]，Yr15 又與Yr24/Yr26 緊密連鎖[25]，顯然，條銹病抗源比較單一。同時在國際上已公布的抗條銹基因中，尚未發現源于中間偃麥草的報道[4-5]。本研究中抗條銹病新基因YrCH223 的分子鑒定，對于進一步豐富小麥抗病基因的遺傳多樣化，防止或延緩抗性“喪失”有重要作用。

抗病基因的準確定位有助于抗源的有效利用。SSR標記以其多態性高、信息豐富、操作簡單、結果穩定的優點常常被研究人員用于新基因的染色體定位[26]。目前，覆蓋整個小麥基因組的微衛星遺傳圖譜和物理圖譜已經建立[16]，根據微衛星位點在圖譜中的位置，可以快速、準確地把與該位點連鎖的基因定位。本研究中則采用SSR標記與BSA相結合的方法篩選到5對與抗病基因連鎖的標記，從而將CH223的抗條銹病基因YrCH223 定位于4BL染色體上。由于在小麥的4B染色體上尚未發現有正式命名的抗條銹病基因[4-5]，因此，YrCH223 是一個新的抗小麥條銹病基因，并被國際小麥基因命名委員會正式定名為Yr50[27]。在暫時命名的抗條銹病基因中，YrCle，YrMor，YrYam，YrND，YrHVII，YrJu3 等雖定位于小麥染色體4B上[28]，但其抗性來源均不是中間偃麥草，這些基因對當前條銹菌優勢小種CYR32，CYR33的抗性還有待進一步研究。YrCH223 的分子標記及定位不僅豐富了小麥抗條銹病育種的遺傳基礎，而且為以后開展小麥分子育種和該抗病基因的圖位克隆提供了重要的科學依據。

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