大腸桿菌BL21(DE3)中定向進(jìn)化突變體庫構(gòu)建的方法比較

陳菲云 張大偉 劉森

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院/分子生物學(xué)研究所 湖北宜昌 443002;2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津 300308)

對三維結(jié)構(gòu)及其功能之間的相互關(guān)系并不明確的酶進(jìn)行改造,定向進(jìn)化方法是很好的選擇。定向進(jìn)化就是利用自然選擇的方法使工程蛋白能夠獲得天然蛋白不具備的特定性質(zhì)的一種方法[1]。它不需要對蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系有深刻的了解,它僅通過隨機(jī)突變或基因重組技術(shù)建立起突變體文庫,然后連接到表達(dá)載體導(dǎo)入宿主內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá),具有改進(jìn)性狀的突變體被篩選出來再進(jìn)行下一輪突變直至得到符合要求的突變體。文獻(xiàn)資料已有大量關(guān)于利用定向進(jìn)化成功改變了分子的特異性和催化性能的例子[2]。

定向進(jìn)化的步驟包括DNA突變庫的體外構(gòu)建和DNA突變庫向宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。其中DNA突變庫的體外構(gòu)建的常見方法已有不少文章總結(jié)過[3,4],本文選擇的是簡單高效的易錯(cuò)PCR法。DNA突變庫向宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是至關(guān)重要的一步,因?yàn)閹烊萘康拇笮∈苻D(zhuǎn)化效率的限制,從而影響獲得好的突變體的機(jī)率。然而應(yīng)用廣泛的表達(dá)宿主菌大腸桿菌雖背景清楚,生長繁殖快,易操作[5],是最常用的定向進(jìn)化宿主菌。但其中作為蛋白表達(dá)常用的BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化效率僅是DH5α的十分之一,不利于突變體庫的建立。綜上,高效的克隆轉(zhuǎn)化方法是定向進(jìn)化方法所需求的。

做克隆最常用的是酶切連接法,是分子實(shí)驗(yàn)常規(guī)的一種分子操作方法。……