常用的基因分離技術及其在茶學研究中的應用

摘要：茶是世界上重要的無酒精飲料之一，同時具有很高的保健價值。近年來，在茶樹分子生物學的研究領域取得了長足進展，許多功能基因被分離和克隆，對這些基因的研究有助于從分子水平上掌握茶樹生物活性物質的代謝調控機制，為茶樹品種改良提供新途徑。介紹了常用的基因分離技術原理及其在茶學研究中的應用，將有助于從宏觀上把握茶樹分子生物學研究的現狀，為厘清科研思路提供理論依據。

關鍵詞：茶學；基因克隆；表型差異克隆

中圖分類號：S571.1；Q781 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-5953-05

基因組是生物體遺傳信息的攜帶者和傳遞者，其中基因是基因組中編碼蛋白質的序列，基因的選擇性表達對應了生物體生長和發育的不同階段，揭示了生命活動的內在機理。在農作物育種中，對決定其重要農藝性狀的功能基因的研究在遺傳改良中具有重要作用，對農作物分子生物學水平的研究具有重大的應用價值。因為轉基因作物巨大的經濟效益和生態效益，現在國內外的農業生產中都十分重視轉基因作物的研究和應用，國內已大量種植轉基因的抗蟲棉花、大豆等。2009年國家農業部通過了轉基因植酸酶玉米和轉基因抗蟲水稻的生物安全性評價，可用于商業生產。因為茶樹是小作物，而且有自交不親和、生長周期長等特點，所以茶樹基因組研究基礎比較薄弱。自1994年Takeuchi等[1]報道了第一條茶樹基因CHS（查爾酮合成酶）序列以來，取得了較快的發展。如今，NCBI GenBank數據庫中已提交的茶樹基因編碼序列達到197條，其中全長序列占137條；預測的蛋白質序列478條；提交的EST序列達到12 664條。但是到目前為止已提交的基因編碼序列中有大量的基因功能未知，重要功能基因僅停留在分離和克隆階段，很多生物活性物質如兒茶素、茶氨酸的代謝途徑尚不清楚。因此，對茶樹功能基因的克隆和初步研究將在一段時間內繼續成為茶樹分子生物學研究的主流，把握其研究現狀和相關的技術將為以后的科研工作提供理論依據，具有重要的參考價值。

常用的基因克隆方法大致可以分為序列克隆、功能克隆、定位克隆、表型差異克隆和測序克隆5種，下面將分別介紹這幾種基因克隆方法的原理及其在茶學研究中的應用。

1 序列克隆——根據已知基因部分或全長DNA或RNA序列獲得基因

1.1 PCR擴增結合RACE技術進行基因克隆

當已知目的基因的序列時（比如通過NCBI網站或者他人的文章得知基因序列）， 通常采用PCR 的方法來克隆基因。其原理和方法是：①如果已知全長序列，對照該序列， 設計并合成1對寡核苷酸作引物， 提取所要從中分離基因的茶樹染色體DNA （如果提取的是RNA，則首先需要在逆轉錄酶的作用下合成cDNA 的第一條鏈）， 然后通過PCR反應得到目的片段，測序后與已知序列進行比對，因為同一條基因在物種內和物種間均存在多態性，因此所得到的序列不一定與已知序列完全相同。②如果只知道序列片段，可以用上述方法先通過PCR技術得到基因片段，然后結合RACE（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）技術得到全長序列。此方法簡便、快速， 尤其適于經費不足、分離一些重要基因起步較晚的情況。

β-葡萄糖苷酶與茶葉香氣物質的形成有關，王讓劍等[2]根據GenBank登錄的這兩種酶蛋白的氨基酸序列設計引物，從龍井43中克隆得到GlUⅠ（β-葡萄糖苷酶Ⅰ）和GlUⅡ（β-葡萄糖苷酶Ⅱ）基因，在大腸桿菌中表達并純化出了有活性的蛋白，為其在茶葉加工研究以及在其他食品中的應用奠定了基礎。類黃酮化合物是具有抗菌、抗氧化等生物活性的一類次級代謝產物， Lin等[3]根據已知的EST序列片段從茶樹中克隆得到全長FLS基因，并用原核表達系統獲得了有活性的蛋白。α-tubulin（α微管蛋白）是茶樹的看家基因，表達量比較穩定，因此可以作為比較基因和蛋白表達水平時的內參，譚振等[4]根據GenBank登錄的α-tubulin mRNA全長序列設計了引物，以RT-PCR方法擴增得到茶樹α-tubulin基因全長，將擴增產物用原核表達系統表達了重組蛋白，并制備相應的抗體，以期為茶樹功能蛋白的Western blot提供內參。陳聰等[5]利用GenBank中公布的茶樹PCP （花粉壁蛋白基因）序列設計引物以龍井43為材料，采用PCR法擴增并測定了茶樹花粉壁蛋白基因內含子序列，并通過序列分析推測該內含子序列可能對PCP基因的表達起到調控作用。PPO基因（多酚氧化酶）對茶葉的品質有重要影響，Liu等[6]根據已知序列，從宜紅早茶樹中克隆得到PPO基因，首次用原核系統表達出了有活性的PPO蛋白。Wu等[7]從5個不同的茶樹栽培種中克隆出了PPO基因，用原核系統表達獲得了活性蛋白，并用特殊的載體使其結構發生變化，分析了這種變化對酶活性的影響。Kirita等[8]從一個印度茶樹栽培種中克隆了一個新的O-甲基轉移酶基因。

1.2 根據跨種序列同源性克隆植物基因

生物的種、屬之間， 基因編碼序列的同源性大大高于非編碼區的序列。在植物或微生物中的同源基因已被克隆的前提下， 可先構建目的物種的cDNA 文庫或基因文庫， 然后以已知的同源基因（或者部分序列） 為探針來篩選目的文庫獲得目的基因。1994年Takeuchi等[1]用此方法克隆得到了3個查耳酮合成酶的基因序列CHS1、CHS2和CHS3，這是茶樹種最早克隆得到的基因，筆者還分析了光線和各種糖對它們表達水平的影響。同年，Matsumoto等[9]用以水稻PAL（苯基丙氨酸解氨酶）的cDNA為探針，從茶樹中克隆得到了PAL基因，同樣的方法還用于克隆得到了茶樹的β-tubuline基因[10]。ANR（花色素還原酶）是茶樹中具有抗氧化作用的活性物質EGCG合成途徑中的一個關鍵酶，鄭華坤等[11]根據GenBank已報道的不同植物ANR基因的保守區域設計1對特異引物得到茶樹ANR基因片段，進而結合RACE技術從高EGCG茶樹品種中克隆得到ANR基因全長序列，并通過原核表達系統得到了預期大小的蛋白。類黃酮化合物是具有抗菌、抗氧化等生物活性的一類次級代謝產物，茶樹FS（黃酮合成酶）基因是類黃酮合成途徑的關鍵酶，喬小燕等[12]根據其他物種保守序列設計兼并引物，利用RT-PCR和RACE技術，克隆得到了FSⅡ基因，并分析了其在不同部位的表達水平，對于從分子水平認識、調控茶樹類黃酮化合物的生物合成，進行遺傳改良具有現實意義。

2 功能克隆——根據基因表達產物蛋白質克隆基因

對于未知基因序列， 但其生理生化及代謝途徑比較清楚的蛋白質，通常采用功能克隆的方法獲得基因。首先， 分離和純化目的蛋白質或者多肽，并對它們進行氨基酸序列分析， 根據氨基酸序列反推出DNA編碼序列，然后設計特異性引物，采取PCR的方法克隆出該基因。

1999年Kato等[13]純化到了TCS（咖啡因合成酶）的蛋白，分析了酶動力學。2000年通過對該蛋白進行測序[14]，利用RACE技術克隆得到了TCS1基因的全長和UTR序列，并在大腸桿菌中表達得到了有活性的蛋白。因為茶樹的很多重要的酶，如茶氨酸合成酶蛋白質非常不穩定，難以得到純的蛋白，所以很難用這種方法得到編碼基因序列，目前應用并不多。但是隨著蛋白質純化技術的進步，功能克隆技術將在茶樹分子生物學特異性功能基因的克隆中發揮難以替代的作用。

3 定位克隆——根據連鎖圖譜和標簽來定位和克隆基因

定位克隆的前提是構建遺傳連鎖圖譜或者有標簽的突變體庫。構建遺傳連鎖圖譜的方法為：首先利用SSR 等分子標記技術進行基因定位，然后以緊密連鎖的分子標記為起點，篩選DNA YAC文庫，構建目的基因區域的物理圖譜，通過染色體步移逐步向目標基因靠近，最終克隆到目的基因并通過遺傳轉化和功能互補試驗證實基因功能。操作前提是具有一個根據目的基因的有無而建立起來的遺傳分離群體；構建精細的遺傳連鎖圖譜，能夠將目的基因定位到染色體的特定位置；還需要構建含有大插入片段的基因組文庫作為以連鎖的分子標記篩選目的基因用。這種方法在水稻、玉米、小麥、甘藍等的一些研究中應用廣泛。常常用來分離克隆與質量性狀如抗病性，數量性狀如產量等相關的基因。茶樹因為自交不親和、生長周期長等特點，遺傳圖譜構建較為困難，還未見通過此方法克隆得到基因的報道。轉座子和T-DNA標簽技術適用易于遺傳轉化和基因組全序列已知的物種，在水稻、擬南芥的研究中廣泛使用，取得了大量的科研成果，但是在茶樹研究中還沒有應用。

4 表型差異克隆——根據表型差異或組織器官特異表達差異克隆基因

4.1 DDRT-PCR

DDRT-PCR 技術適用于多個樣品間的比較，且操作簡便，靈敏度高，應用較為廣泛。在動物中QM基因編碼核糖體蛋白L10，與癌癥的抑制有關。Singh等[15]以茶樹干旱、GA和ABA處理過的樣品為研究對象，通過DDRT-PCR結合RACE技術克隆到了茶樹的QM類似基因，通過對該基因的表達調控分析發現其與旺盛的生長有關，受干旱和ABA的抑制，受GA的誘導。Sharma等[16]以干旱處理、ABA處理和對照3個茶樹mRNA文庫為材料，用DDRT-PCR技術首次得到了茶樹的3個干旱相關EST序列，分析了其對干旱和ABA的應答。王新超等[17]對安吉白茶正常和白化葉片進行差異基因的篩選，得到5個已知的和7個未知的基因片段，對這些基因的研究將有助于了解安吉白茶葉片白化的分子機理。韋朝領等[18]利用DDRT-PCR技術初步研究了茶樹被害蟲茶尺蠖取食后基因表達譜差異，得到222條差異片段，并對其中20條進行了分類，為揭示茶樹的茶尺蠖防御機制提供了試驗依據。

4.2 cDNA-AFLP

cDNA-AFLP技術具有重復性好、假陽性低等優點，是迄今為止茶樹表型差異克隆中應用最多的一種技術。Fang等[19]在研究花發育相關基因過程中克隆得到Tua1基因，該基因與α-tubulin基因同源，用原核系統表達出了蛋白，發現該蛋白可以促進花粉管的生長，有證據表明該基因可能與雄性不育相關。余梅等[20]以大葉烏龍發育早期和晚期的花蕾為材料，用cDNA-AFLP技術分析了差異表達的基因，克隆得到了CsPSP1（花粉特異表達基因），與煙草PSP1基因同源性高達81%，分析其內含子和序列特征，并推測該基因可能在花粉的萌發和花粉管的伸長中起作用。在擬南芥中的研究表明14-3-3 蛋白是一個調節蛋白，能與許多功能不同的信號蛋白結合，其在信號轉導、細胞周期調控等過程有重要作用，是細胞內信息傳遞的重要信號分子，余梅等[21]研究發現茶樹中也存在14-3-3蛋白，且僅在花發育晚期表達。作為喜熱植物，抗寒性對江北茶樹種植十分重要，陳暄等[22]利用cDNA-AFLP 技術進行了茶樹低溫脅迫處理的基因表達差異分析，獲得低溫誘導后特異表達的差異片段，經BLAST 比對發現該片段與白菜、擬南芥、煙草的抗寒基因CBF（C-repeat binding factor）分別有94%、84%、81%的同源性，而后通過RACE技術獲得該片段cDNA全長序列。房婉萍等[23]用同樣的方法得到了另一個冷誘導基因CBF和H1-histone1。陳暄等[24]分析了結實率差異顯著的龍井43和大葉烏龍2個茶樹品種在花蕾發育過程中基因表達的差異。從獲得的差異圖譜中，克隆得到一個與茶樹花發育相關的鈣依賴蛋白激酶基因片段，然后用RCAE方法擴增獲得其cDNA全長序列，命名為茶樹TCK基因。陳林波等[25]利用cDNA-AFLP 技術結合RACE技術獲得了茶樹低溫誘導的一個轉錄因子RAV基因，與多種植物RAV蛋白具有高度同源性。通過對基因表達模式的分析推測該基因在組織中的表達受到嚴格控制，而且在響應非生物脅迫中發揮重要作用。

4.3 SSH

作為表型差異克隆技術的一種，SSH技術較為先進，具有假陽性低、敏感性高、特異性強、操作簡便等優點。在煙草、水稻、柑橘、油菜等抗性基因的分離中應用較多。在茶樹中尚未見報道。

5 測序克隆——通過測定DNA序列克隆基因

5.1 EST測序

表達序列標簽EST（Expressed sequence tag）是源于mRNA（cDNA）短的、單向測定的序列片段[30，31]， 也是一種發現新基因和研究基因表達譜的有效工具。近年來， 構建cDNA文庫并進行大規模測序已成為一種高效率、低成本的發現新基因的技術，在茶學研究中應用廣泛。Chen等[32]構建了龍井43和安吉白茶2個茶樹品種新梢的cDNA文庫，在大量測定龍井43 cDNA文庫EST序列的基礎上，獲得了CHI（查爾酮異構酶）和FS（黃酮醇合成酶）等基因。在已有EST文庫的基礎上，張亞麗等[33]克隆得到了ACC氧化酶全長基因并進行了表達譜分析，推測可能與抗寒性狀有關。紫陽1號是一個常年不開花不結果的特異茶樹種質，李冬花等[34]以紫陽1號新梢為材料，構建cDNA文庫，進行了EST測序，獲得了大量已知功能基因、46個未知功能基因和26個未找到同源序列的基因。這些成果將為茶樹花發育相關研究提供理論依據。因為基因表達具有組織和器官特異性，史成穎等[35]以茶樹嫩根為材料構建cDNA文庫，進行了EST測序，初步確定已知功能基因734個， 推定功能基因102個， 未知功能基因178個。這些結果既為進一步分離克隆茶樹根部功能基因奠定了基礎， 又為以后差異雜交獲取茶樹根部特定代謝途徑的酶基因及相關的調控基因提供了平臺。

5.2 全基因組測序

一個生物的全基因組序列蘊藏著這一生物的起源、進化、發育、生理及所有與遺傳性狀有關的重要信息。對農作物進行全基因組測序將大大加快其分子生物學研究進程，加快良種培育的速度。迄今為止，擬南芥、水稻、玉米、高粱、大豆、野草莓等農作物的全基因組測序已經完成。棉花全基因組測序已經啟動。茶樹的全基因組測序也在進行中。

參考文獻：

[1] TAKEUCHI A， MATSUMOTO S， HAYATSU M. Chalcone synthase from Camellia sinensis isolation of the cDNAs and the organ-specific and sugar-responsive expression of the genes[J]. Plant Cell Physiol，1994，35（7）：1011-1018.

[2] 王讓劍，江昌俊，張正竹，等.兩種茶樹β-葡萄糖苷酶基因cDNA在原核中表達的研究[J]. 生物技術通報，2007（4）：102-105，116.

[3] LIN G Z， LIAN Y J， RYU J H， et al. Expression and purification of His-tagged flavonol synthase of Camellia sinensis from Escherichia coli[J]. Protein Expression and Purification，2007，55（2）：287-292.

[4] 譚 振，童 鑫，房 超，等.茶樹α-tubulin基因的原核表達及其多克隆抗體的制備[J].茶葉科學，2009，29（5）：336-340.

[5] 陳 聰，江昌俊，葉愛華，等.茶樹PCP基因內含子的克隆與序列分析[J].安徽農學通報，2009，15（11）：69，190.

[6] LIU J W， HUANG Y Y， DING J， et al. Prokaryotic expression and purification of Camellia sinensis polyphenol oxidase[J]. J Sci Food Agric，2010，90（14）：2490-2494.

[7] WU Y L， PAN L P， YU S L， et al. Cloning， microbial expression and structure-activity relationship of polyphenol oxidases from Camellia sinensis[J]. J Biotechnol，2010，145（1）：66-72.

[8] KIRITA M， HONMA D， TANAKA Y， et al. Cloning of a novel O-methyltransferase from Camellia sinensis and synthesis of O-methylated EGCG and evaluation of their bioactivity[J]. J Agric Food Chem，2010，58（12）：7196-7201.

[9] MATSUMOTO S， TAKEUCHI A， HAYATSU M， et al. Molecular cloning of phenylalanine ammonia-lyase cDNA and classification of varieties and cultivars of tea plants （Camellia sinensis） using the tea PAL cDNA probe[J]. Theor Appl Genet，1994，89：671-675.

[10] TAKEUCHI A， MATSUMOTO S， HAYATSU M. Amplification of β-tubulin cDNA from Camellia sinensis by PCR[J]. Bull Natl Res Inst Veg Orna Plants Tea，1994（7）：13-20.

[11] 鄭華坤，黃志偉，顏霜飛，等.茶樹花色素還原酶基因的克隆與原核表達[J].福建農林大學學報（自然科學版），2008，37（6）：620-624.

[12] 喬小燕，馬春雷，陳 亮.茶樹黃酮合成酶Ⅱ基因全長cDNA序列的克隆和實時熒光定量PCR檢測[J]. 茶葉科學，2009，29（5）：347-354.

[13] KATO M， MIZUNO K， FUJIMURA T， et al. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves[J]. Plant Physiol，1999，120（2）：579-586.

[14] KATO M， MIZUNO K， CROZIER A， et al. Caffeine synthase gene from tea leaves[J]. Nature，2000，406：956-957.

[15] SINGH K， PAUL A， KUMAR S， et al. Cloning and differential expression of QM like protein homologue from tea [Camellia sinensis（L.） O. Kuntze][J]. Mol Biol Rep，2009， 36：921-927.

[16] SHARMA P， KUMAR S. Differential display-mediated identification of three drought-responsive expressed sequence tags in tea[Camellia sinensis（L.） O. Kuntze][J]. J Biosci，2005，30（2）：231-235.

[17] 王新超，趙麗萍，姚明哲，等.安吉白茶正常與白化葉片基因表達差異的初步研究[J].茶葉科學，2008，28（1）：50-55.

[18] 韋朝領，高香鳳，葉愛華，等.基于DDRT-PCR研究茶樹對茶尺蠖取食誘導的基因表達譜差異[J].茶葉科學，2007，27（2）：133-140.

[19] FANG W P， JIANG C J， YU M， et al. Differentially expression of Tua1， a tubulin-encoding gene， during flowering of tea plant Camellia sinensis（L.） O. Kuntze using cDNA amplified fragment length polymorphism technique[J]. Acta Biochim Biophys Sin，2006，38（9）：653-662.

[20] 余 梅，江昌俊，葉愛華，等.茶樹花粉特異蛋白基因CsPSP1的分離及序列分析[J].激光生物學報，2008，17（2）：206-212.

[21] 余 梅，江昌俊，房婉萍， 等. 茶樹花蕾14-3-3蛋白基因的分子克隆及差異表達分析[J]. 中國農業科學，2008，41（10）：2983-2991.

[22] 陳 暄，房婉萍，鄒中偉，等.茶樹冷脅迫誘導抗寒基因CBF的克隆與表達分析[J].茶葉科學，2009，29（1）：53-59.

[23] 房婉萍，鄒中偉，侯喜林，等.茶樹冷脅迫誘導H1-histone基因的克隆與序列分析[J]. 西北植物學報，2009，29（8）：1514-1519.

[24] 陳 暄，湯茶琴，鄒中偉，等.茶樹花發育相關的一個鈣依賴蛋白激酶基因的克隆與表達分析[J].茶葉科學，2009，29（1）：47-52.

[25] 陳林波，李葉云，王 琴，等.茶樹冷誘導基因RAV的克隆與表達特性分析[J].植物生理學通訊，2010，4：354-358.

[26] LIANG P， PARDEE A B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction[J]. Science，1992，257（5072）：967-971.

[27] BACHEMC W B， HOEVENVANDER R S， BRUJIN S M， et al. Visvalization of differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP： Analysis of gene expression during potato tuber development[J]. Plant J，1996，9（5）：745-753.

[28] LISITSYN N， WIGLER M. Cloning the differences between two complex genomes[J]. Science，1993，259（5097）：946-951.

[29] DIATCHENKO L， LAU Y F， CAMPBELL A P， et al. Suppression subtractive hybridization： a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（12）：6025-6030.

[30] TNRRIER N， AGEORGES A， ABBAL P， et al. Generation of ESTs from grape berry at various developmental stages [J]. J Plant Physiol，2001，158（12）：1575-1583.

[31] WANG Y C， CHU Y G， LIU G F， et al. Identification of expressed sequence tags in an alkali grass （Puccinellia tenuif lora） cDNA library[J]. J Plant Physiol，2007，164（1）：78-89.

[32] CHEN L， ZHAO L P， GAO Q K. Generation and analysis of expressed sequence tags from the tender shoots cDNA library of tea plant（Cam elliasinensis）[J]. Plant Sci，2005，168（2）：359-363.

[33] 張亞麗，喬小燕，陳 亮. 茶樹ACC氧化酶基因全長cDNA的克隆與表達分析[J].茶葉科學，2008，28（6）：459-467.

[34] 李冬花，姚麗娟，余有本，等.特異茶樹種質紫陽1號cDNA文庫構建及ESTs初步分析[J].安徽農業大學學報，2009，36（3）：347-350.

[35] 史成穎，宛曉春，江昌俊，等.茶苗嫩根cDNA文庫的構建和EST分析[J].南京農業大學學報，2009，32（1）：126-130.