兩種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶部分酶學(xué)性質(zhì)研究

摘要：對(duì)串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）和禾谷鐮刀菌（F. graminearum）所產(chǎn)葡萄糖淀粉酶部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明這2種鐮刀菌產(chǎn)的葡萄糖淀粉酶的性質(zhì)較為相似。50～60 ℃酶活性較高，最高酶活性出現(xiàn)在50 ℃，串珠鐮刀菌比禾谷鐮刀菌所產(chǎn)生的酶熱穩(wěn)定性稍高。pH 5.0～6.0之間酶活性較高，pH 5.0～8.0之間穩(wěn)定。金屬離子Mn2+、Cu2+對(duì)2種鐮刀菌產(chǎn)酶的酶活性有較強(qiáng)的激活作用，其中Mn2+激活作用最強(qiáng)烈，Mn2+作用后禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌葡萄糖淀粉酶的活性分別為對(duì)照的176%和173%。金屬離子Na+、Ca2+及Fe2+則會(huì)抑制這2種鐮刀菌產(chǎn)葡萄糖淀粉酶的活性。

關(guān)鍵詞：串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）；禾谷鐮刀菌（F. graminearum）；葡萄糖淀粉酶；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）24-6026-04

葡萄糖淀粉酶（E.C 3.2.1.3）從淀粉的非還原端水解α-1，4糖苷鍵產(chǎn)生β-D-葡萄糖，由于葡萄糖淀粉酶對(duì)淀粉的水解以葡萄糖為惟一產(chǎn)物[1]，因此葡萄糖淀粉酶在以葡萄糖為原料的一些生物行業(yè)有廣泛應(yīng)用，特別是在食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等領(lǐng)域[2，3]。

工業(yè)上應(yīng)用的葡萄糖淀粉酶主要來(lái)自于曲霉屬（Aspergillus）及根霉屬（Rhizopus）[4-10]， 鐮刀菌屬（Fusarium）的葡萄糖淀粉酶報(bào)道較少。曲霉屬及根霉屬菌株葡萄糖淀粉酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究較多[6-10]，鐮刀菌屬的葡萄糖淀粉酶，如半裸鐮刀菌（F. pallidoroseum）[11]、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）[11]、茄腐皮鐮刀菌（F. solani）[12]、蔗草鐮刀菌（F. scirpi）[12]等也有報(bào)道，不同來(lái)源的酶性質(zhì)存在很大差異。這些絲狀真菌能夠?qū)⒑铣傻拿傅鞍追置诘桨猓阌诿傅奶崛〖兓２煌瑏?lái)源的葡萄糖淀粉酶性質(zhì)不同，在耐熱性、pH穩(wěn)定性以及催化活性上都存在差別，而不同的生物加工過程需要不同性質(zhì)的酶，因此對(duì)新型的葡萄糖淀粉酶進(jìn)行篩選并開展性質(zhì)研究顯得特別重要。

前期對(duì)幾十株真菌進(jìn)行了淀粉降解酶的篩選工作，從中得到產(chǎn)酶活性較高的一株串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）以及一株禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），本研究對(duì)其中的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

串珠鐮刀菌以及禾谷鐮刀菌由山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 固態(tài)發(fā)酵 250 mL三角瓶中裝麥麩5 g，加水5 mL，121 ℃蒸汽滅菌。用7 mm打孔器從長(zhǎng)滿菌絲的PDA平板上打出3個(gè)菌斑接種至三角瓶，28 ℃靜置培養(yǎng)。分別于72 h以及96 h搖動(dòng)一次，120 h時(shí)測(cè)定酶活性。發(fā)酵結(jié)束后固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加滅菌蒸餾水100 mL，搗碎，28 ℃搖床振蕩浸提1 h，4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，上清液為粗酶液。

1.2.2 硫酸銨沉淀蛋白 向葡萄糖淀粉酶粗酶液中加入硫酸銨，不斷地緩慢攪拌，直至硫酸銨濃度達(dá)到80 %飽和度，置于4 ℃冰箱過夜；10 000 r/min離心15 min，棄上清，將沉淀蛋白用蒸餾水溶解，透析后用于測(cè)定粗酶的酶學(xué)性質(zhì)。

1.2.3 酶活測(cè)定[13] 底物為用0.1 mol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液體配制的1%可溶性淀粉溶液。25 mL刻度試管中加底物0.9 mL，在測(cè)定溫度下預(yù)熱10 min，加0.1 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，加2 mL DNS溶液，煮沸5 min，流水冷卻，稀釋至25 mL，540 nm測(cè)定吸光值。1 h 釋放1 mg 還原糖（以葡萄糖計(jì)）的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.4 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性[14] 于不同溫度下測(cè)定酶活，最高酶活定為100%，其余酶活與之相比計(jì)算相對(duì)酶活，尋找酶的最適反應(yīng)溫度。取適量酶液不同溫度下保溫，保溫結(jié)束立即置于冰水中冷卻，測(cè)定殘余酶活，研究酶的熱穩(wěn)定性，以不經(jīng)熱處理的酶活為100%。

1.2.5 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性 分別用不同pH的磷酸緩沖液配制可溶性淀粉溶液，測(cè)定酶活，最高酶活定為100%，其余酶活與之相比計(jì)算相對(duì)酶活，尋找最適反應(yīng)pH。取適量酶液分別在不同pH緩沖液中30 ℃保溫6 h，測(cè)定殘余酶活，研究酶的pH穩(wěn)定性；以未處理的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

1.2.6 金屬離子對(duì)酶活力的影響[14] 在反應(yīng)體系中分別加入（鹽酸鹽或硫酸鹽）Cu2+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Na+，使其終濃度為2 mmol/L，室溫下靜置30 min，測(cè)定酶活；以不加金屬離子的空白對(duì)照酶活為100%。

1.2.7 酶解產(chǎn)物的薄層層析[15] 在0.5 mL 1%可溶性淀粉中加入適當(dāng)稀釋的硫酸銨沉淀的酶液0.1 mL，30 ℃反應(yīng)1 h，然后在硅膠板上進(jìn)行薄層層析，展開液為丁醇∶乙醇∶水=5∶3∶2，碘缸內(nèi)染色24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活性

對(duì)2種鐮刀菌進(jìn)行固體培養(yǎng)并測(cè)定酶活性，以實(shí)驗(yàn)室保存的一株黑曲霉為對(duì)照，結(jié)果如圖1所示。黑曲霉葡萄糖淀粉酶酶活為1 206 U/g，串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌分別為783 U/g以及1 065 U/g，比黑曲霉低。

2.2 淀粉酶對(duì)淀粉的酶解產(chǎn)物分析

對(duì)硫酸銨沉淀后的粗酶酶解可溶性淀粉的產(chǎn)物進(jìn)行薄層層析，結(jié)果表明，葡萄糖是惟一可見的酶解產(chǎn)物（圖2），此作用方式為典型的葡萄糖淀粉酶的作用方式，因此串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的淀粉分解酶主要為葡萄糖淀粉酶。

2.3 葡萄糖淀粉酶的最適反應(yīng)溫度

不同溫度下測(cè)定2種鐮刀菌所產(chǎn)葡萄糖淀粉酶的活性（圖3），結(jié)果顯示此酶在50～60 ℃范圍內(nèi)酶活性最高，30～50 ℃有70%以上的活性，溫度達(dá)到60 ℃時(shí)以上酶活性降低。

2.4 葡萄糖淀粉酶的熱穩(wěn)定性

串珠鐮刀菌產(chǎn)生的葡糖淀粉酶在40 ℃以下很穩(wěn)定（圖4），40 ℃保溫90 min酶活性基本沒有損失；50 ℃保溫酶活損失很快，保溫90 min損失70%以上；60 ℃條件下酶活迅速喪失，保溫10 min酶活性已經(jīng)損失90%以上，表明此酶的熱穩(wěn)定性較差。

禾谷鐮刀菌所產(chǎn)葡萄糖淀粉酶與串珠鐮刀菌所產(chǎn)酶的熱穩(wěn)定性基本一致（圖5），可能是由于兩株菌進(jìn)化關(guān)系較近，所產(chǎn)酶的結(jié)構(gòu)也可能較為類似，因此導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性基本一致。

2.5 酶的最適反應(yīng)pH

對(duì)葡萄糖淀粉酶的最適反應(yīng)pH研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6），串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌葡萄糖淀粉酶最高酶活出現(xiàn)在pH 5.0附近，微酸性環(huán)境中酶活性較高，pH小于4.0時(shí)酶活性迅速下降。

2.6 葡萄糖淀粉酶的pH穩(wěn)定性

研究了2種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶的pH穩(wěn)定性（圖7），結(jié)果表明，2種酶在pH 5.0～7.0之間穩(wěn)定性較好，pH 5.0～7.0之間30 ℃放置6 h酶活性保持90%以上，pH 4.0以下酶活性喪失較快。

2.7 不同金屬離子對(duì)2種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶活性的影響

研究了不同金屬離子對(duì)葡萄糖淀粉酶活性的影響（圖8），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mn2+、Cu2+對(duì)2種鐮刀菌葡萄糖淀粉酶活性都有較強(qiáng)的激活作用，其中Mn2+激活作用最強(qiáng)烈，Mn2+作用后禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌葡萄糖淀粉酶的活性分別為對(duì)照的176%和173%。Na+、Ca2+、Fe2+對(duì)酶活性有抑制作用；而K+、Mg2+、Zn2+對(duì)酶活性有輕微激活作用。

3 討論

有關(guān)曲霉屬及根霉屬菌株葡萄糖淀粉酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究較多[6-10]，鐮刀菌屬的半裸鐮刀菌[11]、尖孢鐮刀菌[11]、茄腐皮鐮刀菌[12]、蔗草鐮刀菌[12]、串珠鐮刀菌[16，17]等產(chǎn)葡萄糖淀粉酶也有報(bào)道，不同來(lái)源的酶性質(zhì)存在很大差異。

茄腐皮鐮刀菌[12]產(chǎn)的葡萄糖淀粉酶在50 ℃時(shí)穩(wěn)定，50 ℃保溫60 min 酶活性仍保留79%；Tochukwu等[14]篩選的一株鐮刀菌所產(chǎn)葡萄糖淀粉酶在40～70 ℃之間酶活性都比較高，最高酶活出現(xiàn)在50 ℃，而且熱穩(wěn)定性非常高，70 ℃保存30 min酶活性仍保留78%；尖孢鐮刀菌和蔗草鐮刀菌[9]的最適反應(yīng)溫度分別為30 ℃和40 ℃。本試驗(yàn)中2種鐮刀菌在50 ℃時(shí)有最高酶活性，50～60 ℃之間酶活性較高；然而熱穩(wěn)定性較差，50 ℃保溫1 h酶活力剩余不到50%，其最適反應(yīng)溫度以及熱穩(wěn)定性與報(bào)道的曲霉菌及鏈霉菌屬中葡萄糖淀粉酶的性質(zhì)較為相近[7，8]。

真菌葡萄糖淀粉酶的最適反應(yīng)pH多為酸性，而且一般在酸性及中性pH時(shí)穩(wěn)定[8，12，14]。茄腐皮鐮刀菌[12]在pH 3.0～5.0有較高的酶活性；尖孢鐮刀菌和蔗草鐮刀菌[18]分泌淀粉酶的最適反應(yīng)pH為6.9； Tochukwu等[14]篩選的鐮刀菌在pH 6.5～8.5有較高的酶活性，pH 4.5～7.0穩(wěn)定。而本試驗(yàn)結(jié)果表明，禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌在弱酸性條件下酶活性較高，最高酶活性出現(xiàn)在pH 5.0～6.0。在本研究pH 5.0～7.0條件下酶活性都保留90%以上，pH 4.0以下處理酶活性喪失很快。

大部分淀粉酶的活性都需要有金屬離子的參與，特別是二價(jià)金屬離子對(duì)淀粉酶的活性有激活作用。文獻(xiàn)報(bào)道真菌葡糖淀粉酶一般被Cu2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+等不同程度地激活[9，10，12]，但不同金屬離子對(duì)不同來(lái)源的酶的作用有所差異[5]。茄腐皮鐮刀菌[12]葡萄糖淀粉酶酶活性被Cu2+、Mg2+激活，被Hg2+、Pb2+、Zn2+、Ni2+以及Fe3+抑制；Tochukwu等[14]篩選的菌株所產(chǎn)酶被Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+等激活，被Mn2+以及Fe2+抑制。本試驗(yàn)中，Mn2+、Cu2+對(duì)2種鐮刀菌都有較強(qiáng)的激活作用，其中Mn2+激活作用最為強(qiáng)烈，Na+、Ca2+、Fe2+對(duì)酶活性有抑制作用。

可見，不同來(lái)源的菌株所產(chǎn)的葡萄糖淀粉酶性質(zhì)不同，通過對(duì)不同菌株的篩選研究發(fā)掘不同性質(zhì)的酶可以應(yīng)用于不同的行業(yè)。本試驗(yàn)對(duì)禾谷鐮刀菌以及串珠鐮刀菌所產(chǎn)生的葡萄糖淀粉酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期對(duì)這2種菌葡萄糖淀粉酶的開發(fā)利用提供一定的借鑒作用。

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