兩種茶樹花粉的生活力及貯藏力研究

摘要：為開展茶樹[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]雜交育種工作，以茶樹品種臺茶12號（C. sinensis ‘Taicha 12’）和福鼎大白茶（C. sinensis ‘Fuding-dabaicha’）為試材，采用離體培養法開展花粉生活力與貯藏力研究。結果表明，H3BO3、蔗糖、pH、瓊脂濃度以及萌發溫度對供試的兩種茶樹花粉離體發芽率均有明顯影響。兩種茶樹花粉離體萌發的最適培養基成分均為300 mg/L Ca（NO3）2+200 mg/L MgSO4+100 mg/L KNO3+100 mg/L H3BO3+10%蔗糖+1.0%瓊脂，最適pH 5.4，適宜萌發溫度為16～21 ℃。貯藏溫度對茶樹花粉生活力保持具有顯著影響，溫度越低越有利于花粉活力的保持。-70 ℃最適于茶樹花粉的長期貯藏，貯藏180 d后，臺茶12號、福鼎大白茶的花粉發芽率分別為71.12%、50.61%。在生產實踐中，-20 ℃貯藏茶樹花粉亦可取得較好的效果，貯藏180 d后，臺茶12號、福鼎大白茶的花粉發芽率分別為60.16%、46.88%。

關鍵詞：臺茶12號（C. sinensis ‘Taicha 12’）；福鼎大白茶（C. sinensis ‘Fuding-dabaicha’）；花粉；離體萌發；生活力；貯藏力

中圖分類號：S571.1；Q944.42 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6067-05

茶樹[Camellia sinensis （L.）O.Kuntze]是多年生異花授粉的木本植物，因其葉含有多種對人體有益的功能成分，而被作為一種經濟作物廣泛栽培。生產上茶樹多采用無性繁殖以保持其優良性狀，卻易導致品種退化和病蟲害抗性降低[1]。雜交育種是培育茶樹新品種的重要途徑之一。但茶樹為異花授粉的蟲媒花植物，且開花期間氣溫低、昆蟲活動少，導致茶樹天然結實率較低[2]。在育種實踐中，往往由于茶樹親本的花期不遇給雜交育種工作造成很大困難。茶樹花粉的生活力與貯藏力研究為解決這些問題提供了一條思路，對茶樹雜交育種以及種質資源保存具有一定的理論與實踐意義[3，4]。目前，關于茶樹花粉生活力和貯藏力的研究報道較少[4-8]。鑒于此，以華中農業大學校內種植的兩個茶樹品種為試材，開展花粉生活力與貯藏力研究，以期為茶樹雜交育種與優良種質保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以華中農業大學茶園引種栽培的的兩個品種為試材。臺茶12號（C. sinensis ‘Taicha 12’）：由臺灣省茶葉改良場選育，無性系，灌木型，中葉類，中生種[1，2]。福鼎大白茶（C. sinensis ‘Fuding-dabaicha’）：由福建省福鼎市點頭鎮柏柳村選育，無性系，小喬木型，中葉類，早生種[1，2]。

1.2 方法

1.2.1 花粉采集及貯藏 于2010年12月盛花期間天氣晴好的上午，采集生長良好的福鼎大白茶、臺茶12號的大蕾期花朵。攤放于白紙上，并置于陰涼通風干燥處放置24 h使花蕾開放、花藥開裂。用毛筆輕輕刷下花粉，并置于陰涼通風干燥處，至抖動花粉不結塊時收集。取少許新鮮花粉用于篩選適宜萌發的培養基以及檢測花粉生活力試驗。剩余花粉分別裝入離心管中，以脫脂棉封口，置于干燥器中，花粉體積不超過離心管體積的1/3。將干燥器分別置于室溫（RT）、4、-20、-70 ℃下避光貯藏。

1.2.2 花粉生活力檢測 采用人工離體萌發法檢測花粉生活力，具體試驗方法及步驟如下。

1）花粉的吸水處理。播種前，取新鮮花粉于4 ℃、暗環境、飽和空氣濕度條件下放置2 h，以充分吸水[9]。

2）培養基中各因素對花粉離體萌發的影響。茶樹喜酸性土壤，以臺茶12號為試材，分別設置瓊脂濃度、pH、蔗糖、H3BO3四因素各三個水平，進行正交試驗（表1），以初步確定各因素對花粉離體萌發的影響。播種時，用解剖針將充分吸水的花粉均勻播種于培養基，并將培養基置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，蓋上培養皿，于25 ℃暗培養24 h后觀察花粉萌發情況[10]。每個培養皿于10×10顯微鏡下觀察，每個視野不少于50粒花粉，記錄每個視野的發芽率（萌發花粉數/花粉總數），以花粉管長度大于花粉直徑時記為萌發。取6個視野的平均值作為該培養基的花粉發芽率，初步確定花粉離體培養時各因素適宜的水平。

3）兩種花粉最適離體萌發培養基的篩選。為了篩選兩種花粉最適離體萌發培養基，在上述試驗的基礎上，設置10種固體培養基，pH 5.4，基本成分為1.0% 瓊脂 + 300 mg/L Ca（NO3）2 + 200 mg/L MgSO4 +100 mg/L KNO3，設置3種添加量的蔗糖（5%、10%、15%）和3種濃度的H3BO3（50、100、200 mg/L）進行完全組合，以不添加蔗糖和H3BO3的基本培養基為對照（表2）。

4）萌發溫度對花粉離體萌發的影響。茶樹于冬季低溫期開花。以臺茶12號新鮮花粉為試材，對萌發溫度、培養基瓊脂含量與pH對花粉離體萌發的影響進行了研究。將花粉吸水后播種于最適培養基上，分別置于4 ℃、室溫（16～21 ℃）、28 ℃、37 ℃下進行暗培養，培養8、24 h后進行花粉生活力測定。

1.2.3 貯藏期間花粉生活力的測定 以福鼎大白茶和臺茶12號花粉為試材，取出4種溫度下貯藏0、7、15、30、60、120、180 d的花粉，置于4 ℃下吸水2 h后播種于上述試驗篩選的最適離體萌發培養基，進行生活力測定，以此確定兩種供試花粉的貯藏力。

1.2.4 數據分析 方差分析、多重比較采用SAS 8.1統計軟件分析。所有百分數都進行反正弦轉換后再用于數據分析。

2 結果與分析

2.1 培養條件對茶樹花粉離體萌發的影響

2.1.1 培養基各因素對臺茶12號花粉離體萌發的影響 從表1和表2可以看出，瓊脂、pH、蔗糖、H3BO3 4個因素均對臺茶12號花粉的萌發產生了明顯的影響，各因素對茶樹花粉離體發芽率的影響從大到小為 pH、H3BO3、瓊脂、蔗糖。pH的影響最為明顯，因此，合適的pH對花粉離體培養成功與否至關重要。1.0%的瓊脂更有利于花粉的離體萌發。隨著H3BO3和蔗糖添加量的增多，花粉發芽率總體呈現先升高后降低的趨勢，說明低于和高于最適宜的H3BO3和蔗糖濃度均會對花粉萌發產生一定的抑制作用。根據以上結果，篩選出最適宜臺茶12號萌發的培養基組合為：1.0%瓊脂+10%蔗糖+100 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2+200 mg/L MgSO4 +100 mg/L KNO3，pH 5.4。

2.1.2 最適離體培養基的篩選 由表2可以看出，H3BO3、蔗糖及其交互作用對兩種茶樹花粉的發芽率均有明顯影響。添加蔗糖和H3BO3后，兩種花粉的發芽率均明顯高于對照。當蔗糖添加量一定時，花粉發芽率隨H3BO3濃度增加呈不同的變化趨勢；當H3BO3濃度一定時，花粉發芽率也隨蔗糖添加量的增加呈不同的變化趨勢。可見，適宜濃度的蔗糖、H3BO3對供試茶樹花粉離體萌發有明顯的促進作用。在培養基S2B2上，福鼎大白茶和臺茶12號的花粉發芽率均達到了最大值，分別為54.09%和64.02%，明顯高于其他培養基上的發芽率。可見，培養基S2B2適合茶樹花粉離體萌發。此外，對各種培養基上福鼎大白茶與臺茶12號的花粉發芽率進行比較，兩種茶樹花粉發芽率差異明顯，說明茶樹花粉發芽率存在種間差異。

綜上所述，供試培養基中，最適宜的福鼎大白茶和臺茶12號花粉離體萌發的培養基組成均為：基本成分+10%蔗糖+100 mg/L H3BO3，這與正交試驗結果一致，說明正交試驗結果較為可靠。

2.1.3 培養溫度對茶樹花粉萌發的影響 從表3可以看出，臺茶12號花粉在 4～37 ℃均可萌發。花粉培養8 h后，4 ℃、室溫（16～ 21℃）、28 ℃、37 ℃下的花粉發芽率差異顯著。其中室溫條件下花粉發芽率最高，為37.56%，其次為28 ℃和4 ℃，37 ℃條件下花粉發芽率最低，為11.70%。

隨著培養時間的延長，各溫度條件下的花粉發芽率均有所增加。其中，37 ℃下花粉發芽率始終最小，培養24 h發芽率為14.03%，說明高溫不適宜茶樹花粉的離體萌發。4 ℃下的花粉發芽率增長最快，培養24 h后發芽率已超過室溫和28 ℃，增至最大，達到45.46%。多重比較結果顯示，培養24 h時4 ℃與室溫、28 ℃下的花粉發芽率差異顯著。由此可見，4～21 ℃下茶樹花粉都可以充分萌發，但以低溫下萌發情況較好，可能跟臺茶12號于冬季低溫期開花、授粉的習性具有一定的關系。

2.2 貯藏時間和溫度對茶樹花粉生活力的影響

2.2.1 貯藏時間對花粉發芽率的影響 隨著貯藏時間的延長，各貯藏溫度下福鼎大白茶、臺茶12號花粉的生活力總體呈逐漸降低的趨勢，即貯藏時間越長花粉發芽率越低。對福鼎大白茶而言，整個貯藏期內，不同溫度下貯藏花粉的發芽率呈現很大的差異，但是在貯藏前60 d內，僅有小幅度降低，仍均保持在40%以上。多重比較結果表明，此時不同溫度之間的發芽率無顯著差異。但是在隨后的貯藏時間里，各貯藏溫度之間的發芽率開始呈現顯著差異。其中室溫下發芽率急劇降低，至180 d時，花粉已完全失活；4℃下貯藏60 d后也開始大幅度下降，至180 d時發芽率僅有20.45%；而在-20 ℃和-70 ℃下，在整個貯藏期間花粉發芽率僅有小幅度下降，至180 d時發芽率仍分別有46.88%和50.61%（圖1）。

對于臺茶12號而言，不同溫度下貯藏花粉的發芽率降幅亦呈現很大的差異，但是在貯藏前30 d內降幅均較小，發芽率仍均保持在60%以上。多重比較結果顯示，此時不同溫度之間的發芽率無顯著差異。但是在隨后的貯藏期間，各貯藏溫度之間的發芽率開始呈現顯著差異。其中室溫下貯藏30 d后花粉發芽率開始大幅下降，至180 d時花粉已完全失活；4 ℃下貯藏120 d后開始大幅度下降，至180 d時發芽率僅有18.79%；而在-20 ℃和-70 ℃下，在整個貯藏期間花粉發芽率僅有小幅度下降，至180 d時發芽率仍分別有60.16%和71.12%（圖2）。

綜上所述，隨著貯藏時間的延長，福鼎大白茶和臺茶12號花粉活力均呈現下降的趨勢。但是通過采取降低貯藏溫度的措施可有效延長花粉貯藏期，保持花粉活力在較高水平，同時也說明兩種供試花粉有長期貯藏的潛能。

2.2.2 貯藏溫度對花粉發芽率的影響 從圖1和圖2 可以看出，在相同的貯藏期內，貯藏溫度越低越有利于茶樹花粉活力的保持；貯藏時期越長，貯藏溫度越低越有利于花粉活力的保持。對于福鼎大白茶，短期貯藏（60 d以內）時，4種貯藏溫度之間的發芽率差異不顯著，因此可采用4 ℃或者-20 ℃進行花粉貯藏，簡便易行。在長期貯藏中（180 d）-20 ℃和-70 ℃效果最好，二者之間發芽率差異不顯著，因此亦可采用-20 ℃進行貯藏，以節約成本。對于臺茶12號，短期貯藏（30 d內）各貯藏溫度之間的發芽率差異不顯著，于室溫、4 ℃和-20 ℃下貯藏均可；貯藏120 d內，4 ℃、-20℃和-70 ℃之間差異不顯著，因此，采用4 ℃和-20 ℃下貯藏即可；貯藏180 d時，以-70 ℃貯藏的效果最好，且-20 ℃和-70 ℃之間差異不顯著，因此采用-20 ℃下貯藏亦可較大程度保持花粉的活力。

2.2.3 不同貯藏溫度下花粉顏色的變化 貯藏期間兩種供試花粉的顏色均呈現由金黃色、明亮→黃色、明亮→淡黃色→灰白色不同程度的變化（圖3）。其中，金黃色、明亮的茶樹花粉發芽率高，活力強，隨著顏色變暗，其活力也逐漸降低。當顏色呈灰白色、光澤偏暗時，生活力即喪失。同一品種花粉在不同溫度條件下貯藏180 d后顏色變化差異較大，貯藏溫度越低，顏色保持得越鮮亮，花粉發芽率越高；而貯藏溫度越高，顏色逐漸呈現灰白色，無光澤，花粉發芽率越低，甚至喪失活力。說明茶樹花粉顏色變化與其活力變化具有一定的相關性。因此，在生產實踐中，可根據貯藏花粉的色澤來初步判斷花粉活力的有無，大大簡化了花粉活力檢測手段，提高了工作效率。

3 小結與討論

花粉是種子植物的雄配子體，在有性繁殖中發揮著重要作用。而對新鮮花粉和貯存期間的花粉生活力進行檢測，則可以掌握花粉的形態及生理特征，評估花粉是否有受精能力等[11]。目前，可用于檢測新鮮花粉及貯藏期間花粉生活力的方法有多種[12]，其中花粉離體萌發法因簡便快捷，直觀可靠，花粉發芽率被認為是評估花粉活力的最佳指標[13]，因此，花粉離體萌發法不僅成為最常用的花粉生活力檢測手段，也是分析有性繁殖基本問題的主要思路[14]。

3.1 影響茶樹花粉生活力的因素

在離體培養的各因素中，H3BO3及蔗糖的濃度對花粉離體萌發影響較大[15]，適量的蔗糖和H3BO3有利于花粉的萌發[10，16]。試驗中不同蔗糖、H3BO3添加量對茶樹花粉萌發有明顯的影響，且H3BO3與蔗糖之間存在明顯的交互作用。兩種茶樹花粉萌發的最佳蔗糖、H3BO3添加量均為10%、100 mg/L；適量的蔗糖與H3BO3明顯促進了茶樹花粉的萌發。

其次，培養溫度、pH、瓊脂含量都對花粉離體萌發具有一定的影響。極端培養環境如高溫和高濕脅迫，不僅使花粉萌發受到抑制，而且花粉形態也有可能發生改變[13，17]。本研究中，4 ℃和室溫（16～21℃）下較適宜茶樹花粉的離體萌發，花粉形態和花粉管生長均正常。而在37 ℃下，花粉呈褐色，部分花粉干癟開裂。此外，在28 ℃和37 ℃下培養的茶樹花粉，其花粉管長度明顯短于其他溫度下的，說明高溫不利于茶樹花粉管伸長，這可能與茶樹盛花期間氣溫低、日溫差大等環境因素具有一定的相關性。

3.2 花粉離體萌發的通用培養基

試驗篩選的最適培養基組合（1.0%瓊脂 + 300 mg/L Ca（NO3）2+ 200 mg/L MgSO4 +100 mg/L KNO3 +10% 蔗糖+100 mg/L H3BO3）與Brewbaker等[18]報道的適合39科79屬86種植物花粉萌發的培養基組合基本一致。說明該培養基適合于多數植物的花粉生活力檢測，可作為植物花粉離體萌發的通用培養基。在對某種植物首次進行花粉生活力測定時，可先采用該培養基進行探索，從而簡化了培養基篩選過程，加快了試驗進度，保留了新鮮花粉的活力，保證了試驗的可靠性。

3.3 溫度對茶樹花粉貯藏的影響

花粉活力保持時間由基因型決定[19]，同時植物花粉小，貯藏的營養物質有限，而其呼吸作用又比較強烈。因此，花粉生活力會因高強度呼吸導致花粉養分消耗過度而降低[20]。而貯藏前對花粉進行干燥處理降低花粉含水量，貯藏時選取低溫、低O2含量、避光等條件將使花粉細胞內部各種代謝活動減緩，在相同時間內即可減少花粉有機物質消耗，利于延長花粉的壽命[21]。已有研究證實溫濕度對茶樹花粉貯藏影響較大[4-7]，本研究探討了4種溫度下貯藏兩種供試花粉的活力變化。

貯藏溫度對兩個茶樹品種的花粉生活力保持具有顯著影響，且品種間受貯藏溫度的影響也存在差異。溫度越低越有利于花粉活力的保持，室溫條件下，花粉貯藏120 d生活力即降低至50%以下，180 d后即完全失活。4 ℃可應用于兩種花粉的短期貯藏（60 d內），貯藏60 d時，臺茶12號、福鼎大白茶的花粉發芽率分別為65.60%、45.14%，這為解決茶樹育種授粉時花期不遇提供了較為簡單的解決方案。-70 ℃最適于茶樹花粉的長期貯藏（180 d）；貯藏180 d后，臺茶12號、福鼎大白茶的花粉發芽率分別為71.12%、50.61%；而-20 ℃貯藏180 d后，臺茶12號、福鼎大白茶的花粉發芽率分別為60.16%、46.88%，仍具有一定的雜交可行性，可用于雜交育種工作的開展。因此，可根據實際的貯藏條件和貯藏所需天數制定兩種供試花粉的貯藏方案，巧妙安排，合理利用。由于時間限制，本研究僅進行了180 d，展現了不同貯藏溫度下兩種供試花粉的活力變化趨勢，可以滿足當季雜交工作的開展，但仍有必要探討貯藏360 d時花粉活力的保持情況。此外，貯藏后的花粉能否完成受精作用尚需進一步試驗探討。

參考文獻：

[1] 駱耀平.茶樹栽培學[M].第四版.北京：中國農業出版社，2008.

[2] 江昌俊.茶樹育種學[M].北京：中國農業出版社，2005.

[3] AMMA S， WATANABE A. Long-term storage of germ plasm of tea（Camellia sinensis（L.） O. Kuntze）[J]. Japan Agricultural Research Quarterly，1985，19（3）：196-201.

[4] 楊素娟，王玉書，王 立，等.茶樹花粉的超低溫保存[J].茶葉科學，1993，13（1）：27-30.

[5] 陳國本.茶樹花粉生活力及其貯藏[J].茶葉通訊，1963（4-5）：23-28，15.

[6] 梁月榮.茶樹花粉貯藏的研究[J].中國茶葉，1985（3）：6.

[7] 應華軍.貯藏時間對茶樹花粉生活力的影響[J].中國茶葉，1992（2）：24-26.

[8] 楊盛美，宋維希，唐一春，等.茶組植物花粉生活力測定及種間雜交研究[J].中國農學通報，2010，26（8）：115-118.

[9] 黃意歡.茶學實驗技術[M].北京：中國農業出版社，1997.

[10] 杜克兵，沈寶仙，許 林，等.不同貯藏條件下楊樹花粉生活力變化及隔年雜交授粉應用的可行性研究[J].華中農業大學學報，2007，26（3）：385-389.

[11] 王欽麗，盧龍斗，吳小琴，等.花粉的保存及其生活力測定[J].植物學通報，2002，19（3）：365-373.

[12] STANLEY R G， LINSKENS H F. Pollen： Biology， Biochemistry and management[M].New York，Springer. 1974.

[13] SHIVANNA K R， LINSKENS H F， CRESTI M. Responses of tobacco pollen to high humidity and heat stress： viability and germinability in vitro and in vivo[J]. Sex Plant Reprod， 1991， 4（2）：104-109.

[14] JAYAPRAKASH P， SARLA N. Development of an improved medium for germination of Cajanus cajan（L.） Millsp. pollen in vitro[J]. J Exp Bot，2001，52（357）：851-855..

[15] ACAR I， EROL B A K， SARPKAYA K.Effects of boron and gibberellic acid on in vitro pollen germination of pistachio（Pistacia vera L.）[J]. African Journal of Biotechnology，2010， 9（32）：5126-5130.

[16] 許 林，杜克兵，陳法志，等.川鄂連蕊茶花粉的形態、生活力及貯藏力研究[J]. 園藝學報，2010，37（11）：1857-1862.

[17] JOHRI B M，VASIL I K. Physiology of pollen[J]. The Botanical Review，1961，27（3）：325-381.

[18] BREWBAKER J L， KWACK H K. The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth[J].American Journal of Botany，1963，50（9）：859-865.

[19] 胡適宜.被子植物胚胎學[M].北京：高等教育出版社，1982.

[20] 李合生.現代植物生理學[M].第二版.北京：高等教育出版社，2006.

[21] 杜繼煜，白 巖，白寶璋.植物的花粉[J].農業與技術，2004， 24（6）：84-85.