靈芝發酵豆渣培養條件優化

摘要：為了提高豆渣附加值，以豆渣為基質固體發酵赤靈芝[Ganoderma lucidum（Curtis∶Fr） P. Karst]，通過單因素試驗研究了發酵時間、接種量、培養溫度及蔗糖添加量對靈芝菌絲生長和發酵豆渣多糖含量的影響，并用正交試驗優化了發酵條件。結果表明，蔗糖添加量1.0%、接種量12%、培養時間12 d、培養溫度27 ℃條件下發酵豆渣多糖含量最高。

關鍵詞：赤靈芝[Ganoderma lucidum（Curtis∶Fr） P. Karst]；豆渣；多糖；培養條件

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6135-04

據統計，中國每年豆渣產量在2 000萬t左右，如此大量的豆渣利用是一個難題[1]。研究表明，干豆渣中含20%左右的蛋白質，50%左右的膳食纖維素，10%左右的脂肪，以及豐富的鈣、磷等礦物質元素和維生素，其中含有的膳食纖維素已被稱為第七種營養素，可以預防結腸癌、膽結石、降低膽固醇、預防由冠狀動脈硬化引起的心臟病，降低糖尿病人的血糖水平，是一種優質的保健食品原料，同時，豆渣來源廣泛，價格低，開發保健食品具有廣泛的應用前景[2，3]。為此，以豆渣為固體培養基培養靈芝，研究最佳發酵條件，為豆制品加工副產物利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

赤靈芝菌種，購于華中農業大學食用菌研究中心。豆渣，市售。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備 固體培養基：PAD培養基（土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂17 g，去離子水1 000 mL），分裝于試管，121℃滅菌20 min，擺斜面，備用。

液體培養基：PAD培養基（土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，去離子水1 000 mL），分裝于250 mL三角瓶內，120 mL/瓶，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2.2 菌種的制備

1）菌種活化。在無菌條件下，從原始菌種斜面上挑取0.3 cm×0.3 cm大小菌塊，轉接至斜面培養基，置于培養箱中30 ℃培養5～7 d，菌絲長滿斜面后備用。

2）液體種子的制備。在液體培養基中接入3塊黃豆粒大小的赤靈芝活化菌種，于150 r/min旋轉式搖床30 ℃培養5 d，備用。

3）赤靈芝發酵豆渣工藝流程。新鮮豆渣→復配→滅菌→冷卻→接種→發酵。將50 g豆渣裝入100 mL的三角瓶中，壓實，121 ℃下滅菌20 min，冷卻后無菌條件下接種。

1.2.3 豆渣發酵條件的優化

1）豆渣發酵條件的單因素試驗。①蔗糖添加量對豆渣發酵品質的影響試驗。分別稱取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 g蔗糖，加入50 g鮮豆渣中，混勻，即蔗糖添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，控制溫度27 ℃，接種量8%，培養10 d，通過感官評價及多糖含量確定豆渣發酵的最佳蔗糖添加量；②接種量對豆渣發酵品質的影響試驗。吸取1、2、3、4、5、6 mL的菌液于滅過菌的豆渣培養基中，即接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%，培養溫度27 ℃，蔗糖添加量2%，培養10 d，通過感官評價及多糖含量確定豆渣發酵的最佳接種量。③培養溫度對豆渣發酵品質的影響試驗。在蔗糖添加量2%，接種量8%，培養溫度分別設定為21、24、27、30、33℃的培養箱中培養，培養10 d，通過感官評價及多糖含量確定豆渣發酵的最佳溫度；④發酵時間對豆渣發酵品質的影響試驗。蔗糖添加量2.0%，培養溫度27 ℃，接種量為8%，發酵時間分別為4、6、8、10、12、14 d，通過感官評價及多糖含量確定豆渣發酵的最佳接種量。

2）豆渣發酵最佳條件正交試驗。試驗根據單因素試驗結果，每個因素選取3個水平，通過4因素3水平的正交試驗（表1）分析比較發酵豆渣中多糖含量，確定最佳發酵條件。

1.2.4 指標測定

1）發酵豆渣的感官評定方法。主要針對其外觀、質地及風味3個方面屬性進行評定（表2）。計算公式：感官評定得分=外觀得分×0.4+質地得分×0.3+氣味得分×0.3。

2）多糖含量測定。①葡萄糖標準曲線的制定。精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的100 mg/L標準葡萄糖溶液分別置于15 mL的試管中，加去離子水補足1.0 mL，分別加入5%的苯酚1.0 mL，然后快速加入5.0 mL硫酸（與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便與反應液充分混合），靜置10 min。使用渦旋振蕩器使反應液充分混合，然后將試管置于30 ℃環境中反應20 min，在490 nm波長處測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線（圖1）。②樣品測定。稱量樣品5 g，精確到0.001 g，置于100 mL的三角瓶內，第一次提取料液比為1∶6（m/V，g∶mL，下同），提取2 h，離心分離后再按料液比1∶4加入去離子水提取2 h，合并兩次提取液。吸取提取液0.5 mL加入3倍體積的95%的乙醇混合，靜置過夜以沉淀粗多糖，然后于10 000 r/min離心10 min，棄去上清液。不溶物用1.5 mL的去離子水洗滌溶解，待測。吸取0.1 mL待測樣品，按上述步驟操作，測A490 nm，以標準曲線計算多糖含量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵條件對發酵豆渣感官質量的影響 由圖2可以看出，發酵溫度、接種量、蔗糖添加量和培養時間對豆渣的發酵都有影響，發酵溫度在27 ℃時靈芝菌絲粗壯細密，感官評價最好，溫度過低菌絲生長速度慢，溫度過高菌絲生長細弱，容易液化；接種量越大菌絲生長速度越快，但是接種量加大，發酵體系中水分含量和糖含量會增加，試驗表明接種量為10%比較合適；蔗糖添加量對菌絲影響較大，添加0.50 g蔗糖菌絲生長最好，隨添加量增大，發酵豆渣感官評價值降低，可能與蔗糖增加發酵體系滲透壓加大，不利于菌絲生長，再者，蔗糖添加量增大發酵體系酸堿度降低，從而不利于菌絲生長；培養時間對發酵豆渣也有影響，時間過短，豆渣發酵不充分。

2.1.2 蔗糖添加量對發酵豆渣多糖含量的影響 由圖3可知， 蔗糖添加量對發酵豆渣多糖含量影響不大，不同處理豆渣多糖含量大多在8.00%～11.00%，各處理之間差異不顯著，因此選擇添加量為1.0%作為豆渣發酵優化試驗添加量。

2.1.3 接種量對發酵豆渣多糖含量的影響 由圖4可知，在接種量2%～8%時隨接種量增加，發酵豆渣中多糖含量增大，繼續增加接種量發酵豆渣中多糖含量趨于平穩，可能的原因是接種量低豆渣中靈芝菌絲體生長速度慢，發酵豆渣中纖維素分解速度也慢，多糖含量較低，隨接種量增加，發酵豆渣培養基中靈芝菌絲生長速度增加，在接種量達10%左右時趨于平穩。

2.1.4 溫度對發酵豆渣多糖含量的影響 由圖5可知， 培養溫度對發酵豆渣中多糖含量影響較大，主要原因與發酵豆渣中靈芝菌絲有很大關系，培養溫度低，菌絲生長速度慢，同時，高溫會抑制靈芝菌絲的生長，與感官評價的結果比較一致。

2.1.5 發酵時間對發酵豆渣多糖含量的影響 由圖6可知，隨發酵時間延長，發酵豆渣中多糖含量總體呈先升高后降低的趨勢，在接種后的8 d發酵豆渣中多糖含量最高，然后降低，趨勢與菌絲生長情況比較一致，4 d時發酵時間短，菌絲未吃透，12 d以后菌絲衰敗，出現液化現象。

2.2 豆渣發酵條件的優化

正交試驗結果（表3）表明，影響發酵豆渣多糖含量的因素主次順序依次為蔗糖添加量、培養溫度、發酵時間、接種量，優化得到的豆渣發酵制備靈芝多糖最佳條件為蔗糖添加量1.0%，接種量12%，發酵時間12 d，培養溫度27 ℃，通過優化，發酵豆渣中多糖含量達10.41%，為未發酵前的1.9倍。

3 討論

豆渣是制備豆腐、豆漿等的副產物，每年的量都很大，據統計，每加工1 kg大豆會產生2 kg的豆渣，以此推斷中國每年的豆渣產量在2 000萬t以上。豆渣因具有豐富的營養成分，所以鮮豆渣利用一直是世界難題[4，5]。豆渣中的營養物質的含量能夠滿足藥用真菌的生長要求。丁玉萍等[6]以豆渣為主要原料，應用正交試驗法對香菇液體發酵最佳培養基和發酵條件進行了研究，結果表明，香菇液體發酵最佳培養基配方為葡萄糖2%，MgSO4 0.05%，豆渣9%，KH2PO4 0.1% ，并用洗渣水替代水配料；適宜的發酵條件為發酵時間6 d，裝液量250 mL三角瓶裝液80 mL，發酵溫度25 ℃。靈芝是公認的具有提高免疫力、抗腫瘤活性的藥用真菌，其含有的靈芝多糖等物質具有安神、提高免疫力等作用[7]。傳統獲取靈芝多糖的方法是用靈芝子實體進行提取，提取過程需要消耗大量的熱能和水，而提取率一般在2%以下，提取成本很高[7，8]。研究結果表明，采用豆渣發酵制備靈芝多糖是獲取靈芝多糖的有效方法，發酵豆渣中多糖含量可達10%以上，而且具有豆渣原料便宜、發酵時間短等優點。發酵豆渣培養靈芝獲得的多糖與靈芝子實體中多糖在結構和功能上的區別還需要進一步研究。

參考文獻：

[1] 孫艷輝，董 英.響應面法優化以豆渣為基質發酵納豆菌[J].食品科學，2007，28（4）：208-211.

[2] 謝 婧.豆渣發酵過程中主要營養保健成分變化規律的研究[D].長沙：湖南農業大學，2008.

[3] 肖少香.豆渣發酵技術的研究[J].食品科技，2007（7）：72-75.

[4] 朱運平.豆渣的營養功能特性[J].營養健康新觀察，2006（2）：47-49.

[5] 張振山，葉素萍.豆渣加工的處理與加工利用[J].食品科學，2004， 25（10）：400-406.

[6] 丁玉萍，靖桂云，趙永勛.利用豆渣液體發酵香菇菌絲體的研究[J].食用菌學報，2008，15（1）：62-64.

[7] 靳丹虹，牛艷秋，陳 博，等.不同提取方法對靈芝多糖提取率的影響[J].中國藥師，2008，11（5）：551-552.

[8] 張 鈺，章克昌. 靈芝菌絲體多糖的超濾提取及其抗氧化活性的研究[J].化學世界，2006（1）：33-35.