反相高效液相色譜法對人血漿中甲氨蝶呤的測定

摘要：建立反相高效液相色譜法測定甲氨蝶呤血藥濃度的方法，以指導臨床合理用藥。采用Agilent ZOBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.025 mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH 6.30）-甲醇（76/24，V/V）；流速為1.00 mL/min；檢測波長為313 nm；柱溫為35 ℃；10%（V/V）高氯酸為蛋白沉淀劑。結果表明，血漿中甲氨蝶呤濃度在0.05～5.00 μg/mL（Y1 = 35.556 C+0.771，r=0.999 9）和5.00～100.00 μg/mL（Y2 = 36.727 C +1.700，r=0.999 9）范圍內與峰面積呈良好線性關系，平均回收率為99.03%和97.04%。日內精密度小于1%，日間精密度小于2.5%（n=6），定量濃度為0.05 μg/mL。該方法色譜條件穩定、操作簡單、出峰時間快、線性范圍寬、精密、準確、特異性強、回收率高，適用于甲氨蝶呤血藥濃度的監測。

關鍵詞：反相高效液相色譜法；甲氨蝶呤；血藥濃度

中圖分類號：R927.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6145-03

大劑量甲氨蝶呤-甲酰四氫葉酸鈣（Methotrexate-citrovorum factor，MTX-CF）解救是目前防治兒童急性淋巴細胞白血?。ˋLL）髓外浸潤的主要措施。在該方案實施過程中，MTX血藥濃度個體差異較大，患者體內的MTX血藥濃度過高和持續時間過長是導致其細胞毒性作用的直接原因，而且MTX特異性差，除對腫瘤細胞產生毒性外，對所有快速分裂的正常細胞也有嚴重毒性。因此及時監測MTX的血藥濃度對確保臨床用藥的安全有效具有重要意義。本試驗參考文獻[1-6]，優化了測定血漿中MTX的RP-HPLC法，該法樣品預處理簡單、線性范圍寬、分離效果好、色譜峰對稱、靈敏度高、結果穩定可靠，可為分析人血漿中的MTX提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

血漿樣品由贛南醫學院提供。

甲氨蝶呤對照品（批號100138-200603）購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純，磷酸二氫鈉、高氯酸、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器

Agilent HPLC 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Chem Station Revision化學工作站；XW-80A型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；BS224S型電子天平（德國賽多利斯股份公司）；原子Ⅱ型超純水機（美國艾柯公司）；PB-10型pH 計（德國賽多利斯股份公司）；

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 流動相為0.025 mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH 6.30）-甲醇（76/24，V/V），流速1.00 mL/min，檢測波長313 nm，柱溫35 ℃，10%（V/V）高氯酸為蛋白沉淀劑，進樣量20 μL。

1.3.2 溶液配制 稱取經100 ℃減壓干燥至恒重的MTX對照品0.025 0 g，以去離子水定容至25 mL，得1 000 μg/mL對照品貯備液；將對照品貯備液以去離子水稀釋，配制成1～1 000 μg/mL系列濃度溶液。同法配制1.1、10.5、42.2、105.0、422.0和844.0 μg/mL的質控溶液。

1.3.3 血漿樣品預處理 吸取300 μL血漿，置1 mL離心管中，加入300 μL 10%高氯酸，旋渦混合3 min，離心20 min （14 000 r/min，4 ℃），取上清液300 μL，加入適量1 mol/L氫氧化鈉溶液調溶液pH至中性，渦旋30 s，吸取上清液20 μL進樣分析。

2 結果與分析

2.1 色譜分析

在本試驗條件下，樣品處理方法簡單，分離度良好，峰形對稱，血漿中內源性雜質對MTX測定無干擾，MTX保留時間為3.28 min，見圖1。

2.2 標準曲線繪制

2.3 回收試驗分析

精確吸取質控溶液適量，加入空白血漿配制成質量濃度分別為0.11、1.05、4.22、10.50、42.20、84.40 μg/mL的質控血漿樣品，按樣品處理方法操作，測定血藥濃度，計算回收率，結果見表1。由表1可知，該方法準確度較高。

2.4 精密度分析

2.5 穩定性分析

將已知濃度的 MTX血漿樣品分別置于室溫和4 ℃冷藏條件下避光保存3、6、12、24、36、48 h，分別測定其含量。結果表明，1.05 μg/mL MTX血漿樣品在室溫條件下至少能穩定12 h（1.044 2±0.003 1，RSD=0.296 9%），在4 ℃冷藏條件下至少能穩定48 h（1.043 8±0.003 8，RSD=0.316 1%）。

2.6 臨床應用分析

監測2011-2012年入贛南醫學院附屬醫院血液科的15例使用大劑量MTX的所有患者的血藥濃度，結果見表3。

有報道稱MTX用量可至1～10 g/m2[7]，故在監測MTX血藥濃度的條件下，可適當增加用量，以保證臨床療效。一般認為46 h和72 h時的MTX血藥濃度反映了MTX在體內的排泄情況指標，關系到CF解救劑量和解救次數的選擇，通常將MTX血藥濃度46 h <0.5 μg/mL、72 h < 0.05 μg/mL作為安全濃度，超過上述濃度應追加CF解救。本院治療期間的所有患者，經過及時血藥濃度監測，未出現嚴重不良反應，多為Ⅱ度胃腸道反應。

3 小結與討論

血樣處理方法的選擇直接影響RP-HPLC法的檢測效果。常用的MTX血樣處理方法有液-液萃取法和直接沉淀法[8]，其中直接沉淀法簡便、高效。采用直接沉淀法處理MTX血樣時，沉淀劑的選擇至關重要。MTX不溶于甲醇，其提取回收率過低；在乙腈中紫外吸收下降；用三氯乙酸則血漿雜質峰較多，故這3種溶劑都不宜用作蛋白沉淀劑。本試驗參考文獻[9，10]，以10%高氯酸為蛋白沉淀劑，采用氫氧化鈉中和上清液，該方法可明顯改善高氯酸造成的基線漂移，并能防止強酸對進樣器腐蝕并保護色譜柱。本法最低定量檢測濃度為0.05 μg/mL，能夠滿足日常臨床監測要求。高氯酸用量對MTX的回收率影響較大，當加入高氯酸的量與血漿體積比為1∶1時，對蛋白質的沉淀才相對完全。此外，在離心處理沉淀時，血漿蛋白對MTX具有較強的吸附作用，因此離心轉速以及時間對蛋白質的相對完全沉淀都有重要影響。

本試驗采用反相高效液相色譜法測定血漿中MTX的質量濃度，所需樣本量少、結果穩定、操作簡單快速、線性范圍寬、結果精密準確、回收率高。該法已應用于我院兒科白血病患者MTX血藥濃度的監測，效果良好。

參考文獻：

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