茶樹EST序列中微衛星標記的特征分析及應用

摘要：從NCBI數據庫中獲得47 913條茶樹（Camellia sinensis）EST序列，通過Cd-hit-est除去冗余序列后得到26 185條非冗余序列，利用Misa軟件分析后共發現8 244個微衛星標記分布于6 283條EST序列中，平均相隔1.52 kb出現 1個 SSR，EST-SSR序列出現頻率為23. 99%。其中，單、二和三核苷酸重復為主導類型，占 EST-SSR 總數的 97.83%。A/T、AG/CT和AAG/CTT作為單、二和三核苷酸的優勢重復基元，分別占所屬類型的92.99%、85.11%和26.99%。利用 Primer 5.0軟件，設計了76對引物進行多態性檢測，發現其中59對引物可以擴增出明顯的條帶，34對引物具有多態性，多態性比率高達57.63%，表明茶樹 EST-SSR中的多態性位點比較豐富，比較適合進行大規模的 EST-SSR多態性標記的篩選。

關鍵詞：茶樹（Camellia sinensis）；EST-SSR；分布特征

中圖分類號：S571.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6178-04

微衛星DNA又稱簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR），是基因組中由1～6個核苷酸組成的基本單位重復構成的一段DNA序列。與其他分子標記相比，微衛星DNA多態性高、數量豐富并重復性好，而且具有遺傳共顯性、對基因組有很好的覆蓋性和操作簡便等特點[1-3]。根據SSR標記來源的序列性質不同，SSR標記可分為基因組SSR（Genomic SSR，gSSR）和表達序列標簽SSR（Expressed sequence tag SSR，EST-SSR）兩種。gSSR標記是來源于整個基因組的，而EST-SSR標記則來源于基因組的轉錄區域即表達區，可以直接反映功能基因的多態性，為功能基因的直接鑒定提供了可能性，具有通用性更高的優點[4]。我國是茶樹（Camellia sinensis）的原產地，茶樹也是我國目前非常重要的經濟作物。截至2013年5月，在GeneBank中可獲得47 913條茶樹EST序列， 相比2010年5月時，增加了3倍[5]。基于茶樹EST序列信息的快速擴增，本研究對已有的茶樹EST序列中SSR信息進行了全面的發掘，對其組成、特征及分布進行了分析，同時設計了76對EST-SSR引物，并對19份茶樹樣品材料進行了多態性分析，從而開發了可以用于茶樹的EST-SSR標記，為開發新的茶樹功能基因組SSR標記提供了理論依據，為建立茶樹EST-SSR標記和探索其在功能基因發掘、種質鑒定、遺傳多樣性分析中的應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 EST序列的獲得

1.2 EST-SSR的搜索與預處理

1.3 EST-SSR引物的設計與合成

1.4 基因組DNA提取與PCR擴增

試驗中所用的19份茶樹樣品材料來自中國農業科學院茶葉研究所和湖北省農業科學院果樹與茶葉研究所。采用天根生化科技（北京）有限公司植物基因組DNA提取試劑盒提取每個樣品材料的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其基因組DNA質量，-20 ℃下保存備用。PCR反應體系為15 μL，包括2×PCR Master Mix 7.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各 0.6 μL，基因組DNA 1.0 μL，ddH2O補至15 μL。PCR 反應在Bio-Rad S-1000TM PCR儀上進行。反應程序為：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性 30 s，最適退火溫度退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環；最后 72 ℃延伸 10 min，結束后將產物置于4 ℃保存。PCR 擴增產物采用 8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其多態性，250 V 電泳 2.5 h，電泳結束后銀染顯色，并記錄。

2 結果與分析

2.1 EST-SSR分布頻率及特點

47 913條茶樹 EST 序列經拼接處理后共獲得26 185 條無冗余、高質量的 EST序列。運用Misa軟件對26 185條共12 552 726 bp的非冗余EST序列進行SSR 搜索得到6 283條微衛星序列，占 EST總數的 23.99%。經過統計分析發現，1～6個堿基的排列組合重復均能被檢出，但各種類型的EST-SSR 出現的頻率數量大不相同，共有4 153個單核苷酸型SSR、2 935個二核苷酸型 SSR、977個三核苷酸型 SSR、76個四核苷酸型 SSR、41個五核苷酸型 SSR 及 62個六核苷酸型 SSR。

如圖1 所示，從微衛星數目的角度分析，以單核苷酸重復的數目最多，占 50.38%；其次是二核苷酸重復和三核苷酸重復，分別占 35.60%和11.85%；五核苷酸重復所占比例最低（0.50%）。單、二和三核苷酸為主要重復類型，占EST-SSR總數的97.83%，基元長度大于或等于4的核苷酸重復所占的比例極小，僅為2.17%。

2.2 EST-SSR 基元類型和比例

從圖2可以看出 ，單核苷酸重復類型中，A/T重復頻率最高，占單核苷酸重復數目的92.99%；二核苷酸重復類型中AG/CT重復數目最多（2 498個），占二核苷酸重復數目的 85.11%，AC/GT和AT/AT重復頻率相當，沒有出現GC/GC重復類型；三核苷酸重復10 種類型中，AAG/CTT重復頻率最高（26.99%），其次分別是ACC/CTG（21.29%）、ATC/ATG（13.20%），其他7種基元的頻率均不高于10%；四核苷酸重復類型發現了14種，除AAAC/GTTT（14.47%）、AAAG/CTTT（23.68%）和AAAT/ATTT（13.16%）外，其他類型重復出現的頻率均較低，重復數目低于10個；五、六核苷酸重復數目分別有41個和62個，但是出現次數都很少，均為個位數。

2.3 茶樹EST-SSR引物的多態性分析

利用Primer 5.0軟件，在26 185條 EST序列中隨機選取了其中含有SSR位點的序列進行引物設計，共設計了76對EST-SSR引物。利用這76對EST-SSR引物對19份茶樹樣品進行分析，結果發現其中59對引物能夠擴增出較清晰的條帶，其余17對引物無明顯條帶，即未能擴增出產物。在可擴增出的較清晰條帶引物中，42對引物的擴增條帶大小與預期片段大小相近，另外17對引物擴增條帶大小明顯與預期不符。其中，34對引物能夠擴增出多態性條帶，多態性引物占擴增引物的 57.63%，占所有設計引物的44.74%。圖3為引物A41、A58在19份茶樹樣品中的擴增結果，把這兩個引物結合起來足以有效區分19份茶樹樣品。

3 小結與討論

本研究對47 913條茶樹 EST序列進行了 EST-SSR特征分析。結果表明，茶樹EST序列中分布的微衛星序列相當豐富，含不同重復基元SSR的EST序列有6 283條，約占EST序列的13.11%，該篩出率高于已報道的高梁（Sorqhum bicolor L. Moench）（3.6%）、大麥（Hordeum vulgare）（3.4%）和小麥（Triticum aestivum Linn.）（3.2%），表明茶樹EST-SSR標記具有一定的開發潛力。其中共8 244個EST-SSR序列，平均相隔1.52 kb出現1個SSR，出現頻率明顯高于小麥[7] （1/15.6 kb）、柑橘（Citrus reticulata Blanco）[8]（1/5.7 kb）、大麥[9]（1/6.3 kb）和楊樹（Populus L.）（1/14.0 kb）[10]等植物，這表明茶樹轉錄組中SSR數量很豐富，這種差異可能與搜索SSR的算法（如參數設定）等多種因素有關。

當4種不同的堿基隨機組合時，將可能分別產生 2、4、10、33、102和350種單、二、三、四、五、六核苷酸重復[11]。本研究中單核苷酸的2種重復和三核苷酸的10種重復均有出現，二核苷酸重復中僅缺乏GC/GC重復類型，但大多數四、五和六核苷酸重復均未出現，表現出明顯的偏倚性，且每一種重復類型所占比例也各不相同。單核苷酸重復是主導類型，其次是二核苷酸和三核苷酸。單核苷酸中A/T出現頻率最高，是所有單核苷酸重復類型的92.99%。在二核苷酸重復類型中所占比列最重的是AG/CT，是所有二核苷酸重復類型的85.11%，沒有出現 CG/CG重復。三核苷酸類型中，AAG/CTT、ACC/CTG和ATC/ATG等排列組合出現頻率比較高，依次所占比列為26.99%、21.29%和13.20%。這與金基強等[5]報道的茶樹 EST-SSR 中的優勢重復類型是一致的。

本研究利用EST序列共設計了76對 EST-SSR引物，并對19份茶樹樣品進行了檢測分析，共篩選出具有多態性的SSR引物34對，多態性引物比例為 44.74%。有17對引物不能進行有效擴增，其原因可能是由于擴增區段存在較為復雜高級結構或者是上、下游引物含有內含子。綜上所述，茶樹EST-SSR基元重復類型豐富，多態性位點也較豐富，因此，獲得的SSR標記具有較高的可用性，對于豐富其分子標記類型及數量、建立遺傳圖譜及進行比較基因組研究都有重要意義。

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