頭孢菌素類(lèi)抗生素高分子雜質(zhì)分析探討

摘 要：頭孢菌素類(lèi)抗生素中的高分子雜質(zhì)是引起過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原，也是該類(lèi)藥物分析研究的重點(diǎn)。高分子雜質(zhì)分為外源性雜質(zhì)和內(nèi)源性雜質(zhì)，而內(nèi)源性聚合物是目前藥物質(zhì)量控制的重點(diǎn)。本文對(duì)近年來(lái)頭孢菌素中高分子雜質(zhì)的雜質(zhì)分類(lèi)、來(lái)源、聚合特性、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和分離分析方法研究進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：抗生素；頭孢菌素；高分子雜質(zhì)

頭孢菌素屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，該類(lèi)抗生素具抗菌譜廣、有高效、低毒、耐酶、耐酸等特點(diǎn)。頭孢菌素類(lèi)抗生素一般較為安全，但用于特異體質(zhì)的患者則可能發(fā)生如過(guò)敏性休克的不良反應(yīng)，這就導(dǎo)致在臨床此類(lèi)藥物中受到很大的限制。目前已證實(shí)半合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，如青霉素V、氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑肟鈉、頭孢替唑鈉、頭孢噻啶、頭孢噻吩、頭孢美唑鈉等，能夠形成聚合物，從而引發(fā)過(guò)敏性反應(yīng)。為了保證臨床用藥的安全性和有效性，本文就頭孢菌素類(lèi)抗生素過(guò)敏性反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制、頭孢菌素類(lèi)抗生素高分子雜質(zhì)的定義、來(lái)源、分類(lèi)、分離分析技術(shù)等方面進(jìn)行綜述。

1 過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制

過(guò)敏反應(yīng)也稱(chēng)抗原抗體反應(yīng)，主要指藥物分子降解或聚合形成的雜質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)，與體內(nèi)的大分子如多肽、蛋白質(zhì)及多糖等發(fā)生不可逆的結(jié)合，引起的不良反應(yīng)。頭孢菌素類(lèi)抗生素是指母核為7-氨基頭孢烷酸，含有兩個(gè)側(cè)鏈活性取代基R1和R2。頭孢菌素類(lèi)抗生素水解后的主要產(chǎn)物是側(cè)鏈R1的衍生物，因此推斷頭孢菌素的過(guò)敏反應(yīng)的主要抗原決定簇是側(cè)鏈的R1，這一推測(cè)目前已被許多學(xué)者所證實(shí)。但是，頭孢菌素類(lèi)抗生素本身與其降解產(chǎn)物都是單價(jià)半抗原，這樣的結(jié)構(gòu)并不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，而當(dāng)這些產(chǎn)物與大分子載體如多肽或蛋白等結(jié)合就可形成多價(jià)抗原，這樣這些產(chǎn)物就具有了抗原性。此外，頭孢菌素類(lèi)抗生素自身在一定的條件下就能夠聚合成高分子聚合物，這些聚合物也是引起過(guò)敏反應(yīng)的主要原因。

2 高分子雜質(zhì)分類(lèi)和來(lái)源

藥物雜質(zhì)中相對(duì)分子質(zhì)量比藥物分子相對(duì)分子量大的雜質(zhì)稱(chēng)為高分子雜質(zhì)，這些雜質(zhì)通常相對(duì)分子質(zhì)量為1000～5000。按雜質(zhì)來(lái)源通常可將高分子雜質(zhì)分為兩類(lèi)：內(nèi)源性雜質(zhì)與外源性雜質(zhì)。①內(nèi)源性雜質(zhì)：β-內(nèi)酰胺開(kāi)環(huán)產(chǎn)生的自身聚合反應(yīng)產(chǎn)物，主要來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程的殘留污染和生產(chǎn)、貯存和使用條件下發(fā)生的聚合反應(yīng)產(chǎn)物；②外源性雜質(zhì)：一般來(lái)源于發(fā)酵工藝，如多肽、蛋白、多糖等。

因?yàn)樯a(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)和提高，所以藥物中外源性雜質(zhì)通常較少。因此，控制內(nèi)源性雜質(zhì)是控制抗生素高分子雜質(zhì)的重點(diǎn)和難題。

3 頭孢菌素類(lèi)抗生素中高分子雜質(zhì)的聚合特性

頭孢菌素類(lèi)抗生素主要以兩種方式發(fā)生自身聚合：（1）L型聚合反應(yīng)：7位側(cè)鏈中的活性基團(tuán)親核攻擊β-內(nèi)酰胺環(huán)中的羰基碳原子，形成聚合物（圖1）。（2）N型聚合反應(yīng)：β-內(nèi)酰胺環(huán)一定條件下開(kāi)環(huán)，形成親核的仲氨基結(jié)構(gòu)，然后與另一頭的羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成的自身聚合物。

4 高分子雜質(zhì)的分離分析方法

近些年，關(guān)于頭孢類(lèi)抗生素中高分子雜質(zhì)的分離分析的研究報(bào)道很多，其中反相色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法較為常見(jiàn)。

反相色譜法（RHPLC）是分離分析藥物及其雜質(zhì)的常用方法，但該方法的分離原理與溶質(zhì)的極性相關(guān)，而頭孢菌素類(lèi)抗生素不僅含有較多的高分子聚合物，還有很多自身的降解產(chǎn)物，采用RHPLC分離分析頭孢菌素類(lèi)抗生素，會(huì)獲得一系列的色譜峰，而各個(gè)聚合物的色譜峰峰不是準(zhǔn)確的分布，故很難確定各個(gè)化合物的準(zhǔn)確位置，更難準(zhǔn)確定量各個(gè)化合物。離子交換色譜法一般用于研究高分子聚合物的分離與定性，但是分析方法需要的分離時(shí)間長(zhǎng)，操作也較為繁瑣。因此，反相色譜法和離子交換色譜法主要用于早期的青霉素類(lèi)藥物的研究，目前這2種方法已經(jīng)較少用于頭孢菌素中高分子雜質(zhì)的測(cè)定。

凝膠色譜法是對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量不同的組分組成的混合物依據(jù)分子排阻機(jī)制進(jìn)行快速分離的方法，常用的凝膠介質(zhì)有葡聚糖、親水性多孔硅膠、乙烯共聚體和瓊脂糖等，這是目前最常用于測(cè)定頭孢菌素類(lèi)抗生素中高分子雜質(zhì)的方法。其中，葡聚糖凝膠（Sephadex G10） 是頭孢菌素類(lèi)抗生素中高分子雜質(zhì)分離的常用凝膠介質(zhì)，因?yàn)槠渑抛璧南鄬?duì)分子質(zhì)量大約為1000u。

應(yīng)用實(shí)例：頭孢唑肟鈉高聚物檢測(cè)

（1）樣品配制：取本品約300mg，精密稱(chēng)定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。立即精密量取100μl注入液相色譜儀，以流動(dòng)相A為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。

另取頭孢唑肟對(duì)照品約25mg，精密稱(chēng)定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度；精密量取該溶液10ml，置另一100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，制成每1ml中含頭孢唑肟25μg的溶液，做為對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照溶液100μl注入液相色譜儀，以流動(dòng)相B為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算頭孢唑肟聚合物含量。

（2）色譜條件：

色譜儀型號(hào)：Waters1525 檢測(cè)器：Waters2487

色譜柱： Sephadex G10 檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm

柱溫： 室溫流速：1.5ml/min

（3）流動(dòng)相

A：pH7.0的0.075mol/L磷酸鹽緩沖液；B：水

目前，將凝膠色譜與不同類(lèi)型的檢測(cè)器聯(lián)合應(yīng)用越來(lái)越廣泛，如：與高效液相色譜相連，將凝膠色譜分離得到的雜質(zhì)逐一切換到 HPLC色譜系統(tǒng)中，從而實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的分離和純化；與 二極管陣列檢測(cè)器相連，可分離監(jiān)測(cè)不同雜質(zhì)的光吸收的差別；與質(zhì)譜聯(lián)用，測(cè)定分離得到的雜質(zhì)的相對(duì)分子量，從而初步推定雜質(zhì)的類(lèi)型。

5 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，頭孢菌素類(lèi)抗生素臨床應(yīng)用的一大難題就是其中的高分子雜質(zhì)，特別是內(nèi)源性聚合物雜質(zhì)。為了檢驗(yàn)分離這些高分子雜質(zhì)，不僅僅需要檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、高效，更需要了解高分子雜質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)制，從而在源頭上減少高分子雜質(zhì)。因此，在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中要盡量保持低溫和適宜的濕度，避免產(chǎn)生高分子聚合物；生產(chǎn)過(guò)程要選擇能減少高分子雜質(zhì)最佳的生產(chǎn)工藝。未來(lái)，研究頭孢菌素類(lèi)抗生素的新品種時(shí)，適當(dāng)改造側(cè)鏈以增加側(cè)鏈的空間位阻，以期增加抗菌活性的同時(shí)又能阻止發(fā)生聚合產(chǎn)生高分子雜質(zhì)，使頭孢菌素類(lèi)抗生素的臨床應(yīng)用更為安全、有效、可控。

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