幾種大腸菌群檢測方法的比較

摘 要：大腸菌群的定義：大腸菌群（coliform group）是指一大群需氧或兼性厭氧、在37℃培養24h能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細菌學上的分類命名，而是根據衛生學方面的要求，提出的與糞便污染有關的細菌，即作為食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。根據進一步的生化試驗，可將這群細菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群的檢驗基于它能分解乳糖能產酸產氣、革蘭氏染色陰性的重要特點。

關鍵詞：大腸菌群；發酵法；平板法；產酸產氣

大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。

大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。調查研究表明，大腸菌群細菌多存在于溫血動物糞便、人類經常活動的場所以及有糞便污染的地方，人、畜糞便對外界環境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環境中則以大腸菌群其他型別較多。大腸菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。

1 大腸菌群檢驗方法

由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。

目前國內采用的食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準《食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群的檢驗》GB/T4789.3-2003，《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》GB4789.3-2010，《飲用天然礦泉水檢驗方法》GB/T8538-2008， 《生活飲用水檢驗方法》GB5750-2006。

加拿大的Sharp AN博士等（1974）首次報道。其基本原理是：以疏水物質在5cm2、孔徑為0.45？滋m的濾膜上，橫豎各刻印40條線，將濾膜分為1600個小格，以疏水線作為柵欄，防止菌落擴散。樣品稀釋液首先通過5？滋m的前濾器過濾，再通過0.45？滋m的HGMF濾膜過濾，然后根據所需檢驗菌的特性，將濾膜置于不同的選擇培養基上培養24h～48h，陽性菌落即可通過顯色而進行鑒定，如果是大腸菌群則呈藍色。根據陽性菌落數查“陽性菌落數與單位生長最近似值換算表”即可得出單位樣品中大腸菌群的MPN。本法可在24h～30h得出結果，大腸菌群準確率為100%，無假陽性。該法的優點在于：只使用單一的稀釋度，大大減少了檢驗過程中的隨機誤差和系統誤差；在過濾時除掉了所含的一些固體物質，及一些不利于細菌生長的可溶性物質，便于細菌的生長；因為濾膜先在營養瓊脂上培養4h～5h，再轉移到選擇性培養基，使受傷細菌得以恢復，因此縮短了檢出時間，提高了靈敏度。

1.4.2 GB5750-2006 濾膜法

用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾水樣，細菌被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培養基上，經培養后，計數生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落數。

（1）過濾水樣

用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100mL水浴（如水樣含菌數較多，可減少過濾水樣量，或將水樣稀釋）注入濾器中，打開濾器閥門，在負0.5大氣壓下抽濾。

（2）培養

水樣濾完后，再抽氣約5s，關上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養基（36.1.3.1）上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37℃恒溫箱內培養22～24h。

（3）觀察結果

挑出符合下列特征菌落進行革蘭氏染色、鏡檢：（1）紫紅色，具有金屬光澤的菌落；（2）深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；（3）淡紅色，中心色較深的菌落。

凡革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養基液，于37℃培養24h，有產酸產氣者，則判定為總大腸菌群陽性。

（4）計算濾膜上生長的總大腸菌群數

總大腸菌群菌落數（CFU/100mL）=水樣中的總大腸菌群數報告之（CFU/100mL）/過濾的水樣體積（mL）

2 結果與討論

大腸菌群各檢測方法比較表3。

在大腸菌群檢測方法中發酵法是傳統的檢測方法，GB4789.3-2003操作步驟繁雜、干擾因素多，需要操作者有一定的技術和相對豐富的實踐經驗。消耗的時間和人力較多。適于檢測大腸菌群含量較低的樣品。GB4789.3-2010第一法MPN計數法步驟少，操作簡單，實驗現象明顯，靈敏度高，是國際上通用的檢測方法。適于檢測大腸菌群含量較低的樣品。但是實驗結果的單位是MPN/ml（g），與很多食品標準單位MPN/100ml（g）不一致，使用受到了制約。GB4789.3-2010第二法平板計數法適于檢測含量較高的樣品，檢驗結果比較精確。濾膜法對設備的要求較前幾種方法高，步驟繁瑣，觀察結果不方便，計算繁瑣。紙片快速檢測法的特點在于檢測時間短，步驟簡單方便，適于需要大量快速的檢測機構的檢測，成本相對高。傳統方法具有原理簡單、費用較低、利于推廣的優點，因此仍是常規監測中的主要檢測方法。

3 結束語

大腸菌群的檢驗基于它能分解乳糖能產酸產氣、革蘭氏染色陰性的重要特點，傳統的方法都是通過兩步或三步的發酵法。原理簡單、費用較低，利于推廣的優點，因此仍是常規監測中的主要檢測方法。消耗的人力和時間較多，對于某些保質期不長的食品來說，影響了企業的生產和銷售，對于檢測量較大的檢驗機構來說成本較高。通過實踐經驗的積累，對以上幾種方法的比較后，我認為在實踐中可以根據實際情況結合國家標準，靈活采用各種方法進行檢驗，既能保證實驗準確性，也提高效率。

參考文獻

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作者簡介：易林（1975，11-），男，云南廣南（籍貫），現職稱：工程師，學歷：本科，研究方向：微生物檢測。