Nrf2—ARE信號通路在外傷性腦損傷神經保護作用的機制研究

[摘要] 目的 初步探討Nrf2-ARE通路在外傷性腦損傷保護作用的機制。 方法 采用基因敲除大鼠制作創(chuàng)傷性腦損傷模型。將72只實驗大鼠分為假手術組（Nrf2+/+）、腦損傷組（Nrf2+/+）、假手術組（Nrf2-/-）和腦損傷組（Nrf2-/-），每組18只。損傷36 h后，采用TUNEL法檢測神經細胞凋亡及ELISA蛋白羰基試劑盒檢測蛋白質氧化損傷程度。 結果 假手術組（Nrf2+/+）大鼠與假手術組（Nrf2-/-）大鼠相比，腦組織蛋白羰基濃度及神經細胞凋亡率均無顯著差異（P > 0.05）；而腦損傷組（Nrf2+/+）大鼠及腦損傷組（Nrf2-/-）大鼠的腦組織蛋白羰基濃度及神經細胞凋亡率分別比假手術組（Nrf2+/+）大鼠與假手術組（Nrf2-/-）大鼠高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），但腦損傷組（Nrf2-/-）大鼠的相關指標較腦損傷組（Nrf2+/+）明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結論 Nrf2-ARE通路可能通過減低外傷性腦損傷中腦組織蛋白羰基的濃度，減少神經細胞的凋亡，從而發(fā)揮神經保護作用。

[關鍵詞] 外傷性腦損傷；Nrf2-ARE通路；氧化應激；神經保護

[中圖分類號] R651.1+5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）11-0011-03

外傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）指由外傷因素所致嚴重腦組織損害的一類疾病，已嚴重影響人類的健康[1]。其中，TBI后神經元繼發(fā)性損傷（secondary brain injury，SBI）是造成腦損傷發(fā)生、發(fā)展的重要原因[2]。近年來，有研究者認為氧化應激損傷在外傷性腦損傷機制中占有重要的地位[3]。有研究結果表明Nrf2-ARE通路可能參與了TBI后內源性應激防御機制[4，5]，但其神經保護作用機制尚未得到完全闡明。因此，本研究采用外傷性腦損傷大鼠模型，觀察Nrf2-ARE通路對TBI后大鼠神經細胞凋亡及氧化應激損傷指標的作用，探討該通路在TBI后發(fā)揮神經細胞保護作用的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

（Nrf2-/-）大鼠及（Nrf2+/+）大鼠由浙江大學醫(yī)學院動物實驗中心提供。其中，前者DNA基因的引物序列為5’-GCGGATTGACCGTAATGGATAGG-3’，而后者DNA基因的引物序列為5’-CGCCTTTTCAGTAGATGGAGG-3’。所有大鼠均在自由飲食條件下飼養(yǎng)。

1.2 試劑和儀器

原位末端標記（TUNEL）試劑盒（Promega公司）；ProteinCarbonyls ELISA Kit試劑盒（RD Systems公司，美國）；多功能酶標儀（BioTek 公司，美國）；Labo fuge 400R高速離心機（Heraeus公司，德國）；電子顯微鏡（OLYMPUS，日本）等。

1.3 動物模型制備及大鼠分組

采用BenchmarkTM法制備TBI動物模型[6]。過程如下：麻醉成功后，暴露顱骨。距矢狀縫中線右1 mm，在人字縫與冠狀縫處鉆孔，直徑約0.4 cm，打開硬腦膜。將撞擊器裝配在立體定位儀上，將撞擊器的頭端與冠狀面平行，而與大鼠頭顱矢狀面呈8°角度垂直固定于硬腦膜上。采用2.5 mm直徑的撞擊頭，以3.5 m/s撞擊速度、0.8 mm打擊深度、90 ms打擊時間制作中度外傷性腦損傷。假手術組大鼠無沖擊損傷過程，其余步驟同模型組。將基因敲除大鼠分四組：假手術組（Nrf2+/+組）、腦損傷組（Nrf2+/+組）、假手術組（Nrf2-/-組）和腦損傷組（Nrf2-/-組），每組18只。18只大鼠均在損傷36 h后處死，其中9只取右側損傷灶腦組織，-70℃冰箱保存，待腦組織蛋白羰基的濃度檢測；其余9只行TUNEL染色并在光鏡下（×400）觀察凋亡細胞。

1.4 指標檢測

1.4.1 組織蛋白羰基濃度測定 嚴格按ProteinCarbonyls ELISA試劑盒步驟說明書操作測定。

1.4.2 TUNEL染色 嚴格按照試劑盒檢測步驟進行操作。TUNEL染色在光鏡下（×400）觀察凋亡細胞（以胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒代表），計算TUNEL陽性率即TUNEL陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比值并采圖。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件，所有數(shù)據均以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，相同基因型或不同基因型間兩兩比較均采用配對t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 組織蛋白羰基濃度比較

3 討論

有研究表明，Nrf2作為一個重要的細胞內轉錄因子，對防御各種內源性應激損傷起到積極的調控作用且廣泛分布于機體的各個組織器官中[7]。Nrf2屬于CNC轉錄因子家族成員。CNC家族除Nrf2外，還包括P45、Nrf1和Nrf3，而其中Nrf2為細胞防御各種應激損傷的關鍵轉錄因子[8，9]。有研究報道，位于Ⅱ相解毒酶基因分子順式作用元件的其中一段增強子序列的5’端中含有一個抗氧化反應基團，Nrf2-Maf異二聚體可與此處結合以增強其下游靶基因的表達，從而構成Nrf2誘導Ⅱ相酶基因表達的必需調節(jié)因子[10]。當受到活性氧或親電子物質的信號攻擊后，Nrf2被磷酸化后從復合物中解離[11]，構成新異二聚體后又與抗氧化反應元件ARE上GCTGAGTCA位點結合，使下游靶基因的表達得以激活，進一步調節(jié)抗氧化酶蛋白，相繼啟動ARE作用的抗氧化酶基因及Ⅱ相解毒酶的表達，如HO-1、NQO-1等，從而發(fā)揮神經細胞保護作用。最近，已有研究證實Nrf2-ARE通路在中樞神經細胞中發(fā)揮內源性抗氧化作用來減輕氧化應激所致的神經元損傷。但該通路是否具有保護腦外傷后的神經細胞的作用及其相關機制尚不明確。為盡量減少藥理學局限性的干擾，更準確地了解Nrf2-ARE通路在外傷性腦損傷中的保護神經細胞作用及其機制，本研究采用Nrf2基因敲除大鼠對Nrf2在外傷性腦損傷中的作用及機制進行進一步的研究。

目前認為，在外傷性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展的過程中，繼發(fā)性損傷是非常重要的因素，它也是顱腦外傷后造成患者死亡和影響后續(xù)康復的主要原因。為此，積極治療繼發(fā)性腦損傷對于搶救患者的生命及改善預后具有積極的意義。本研究中從病理形態(tài)學（細胞凋亡）客觀地評價繼發(fā)性腦損傷。我們發(fā)現(xiàn)，腦損傷組（Nrf2+/+）及腦損傷組（Nrf2-/-）大鼠都出現(xiàn)不同程度的神經細胞凋亡，但后者較前者表現(xiàn)得更為嚴重，這提示Nrf2對外傷性腦損傷具有抗神經細胞凋亡的作用。這與既往研究報道中Nrf2可減少腦損傷的體積及改善急性腦血管病的神經細胞功能結果相一致[6，12]。

除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)Nrf2-ARE通路對外傷性腦損傷后抗神經細胞凋亡的作用與其抑制氧化應激損傷有關。有研究表明，氧自由基在外傷性腦損傷后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了非常重要的作用。腦細胞損傷后，產生了大量的氧自由基，其一可直接使蛋白質、脂質及DNA過氧化，破壞細胞膜磷脂結構，促使蛋白質的降解、核酸主鏈的斷裂、細胞的崩解及細胞發(fā)生一系列不可逆的病理改變；其二可通過刺激表達黏附分子和細胞因子，進一步介導炎癥和免疫反應過程，從而加重受損的腦組織細胞功能損傷；其三，氧自由基還可通過抑制線粒體功能等間接途徑使凋亡信號通路得以激活，引起神經細胞的凋亡[13]。上述環(huán)節(jié)互相影響、相互重疊，成惡性循環(huán)，最終導致神經細胞不可逆性壞死。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，腦損傷組（Nrf2+/+）及腦損傷組（Nrf2-/-）大鼠損傷側周邊腦組織中蛋白質氧化損傷指標（蛋白羰基）的表達明顯增高，故提示腦組織中出現(xiàn)氧化應激損傷，同時損傷側腦皮層神經細胞凋亡率也明顯升高，這與以往的研究也是相一致的，在一定程度上說明外傷性腦損傷后發(fā)生明顯氧化應激損傷，從而導致神經細胞的凋亡。但腦損傷組（Nrf2+/+）及腦損傷組（Nrf2-/-）大鼠相比，后者氧化應激損傷指標表達及神經細胞凋亡率較前者更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。既往研究也證實，Nrf2對新生兒缺氧性腦病、腦出血以及腦缺血后氧化應激及神經元損傷都具有保護性意義[14]，與本研究結果相一致。由此，我們認為Nrf2-ARE通路對于抑制外傷性腦損傷后氧化應激損傷，抗細胞凋亡具有十分重要的意義。

綜上所述，本研究通過Nrf2敲除大鼠建立外傷性腦損傷模型，證實Nrf2-ARE通路在外傷性腦損傷中發(fā)揮了神經保護作用。其機制可能是通過抑制氧化應激損傷來實現(xiàn)，這為今后積極治療外傷性腦損傷帶來新策略奠定重要的理論基礎。

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（收稿日期：2013-01-18）