酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

摘要：介紹了酶聯(lián)免疫吸附分析方法的原理、類型以及在獸藥殘留檢測(cè)中的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)和國(guó)內(nèi)外應(yīng)用現(xiàn)狀，討論了酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)所存在的問題和發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫分析；獸藥殘留；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S859.84 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2013）10-0059-03

獸藥殘留不僅直接對(duì)人體產(chǎn)生急慢性毒性作用，引起細(xì)菌耐藥性的增加，還通過環(huán)境和食物鏈的作用對(duì)人體健康造成潛在危害。加強(qiáng)獸藥管理和獸藥殘留分析是控制獸藥殘留的重要手段。獸藥殘留的分析方法一般有免疫分析法、氣相色譜法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等。其中，免疫分析法具有高度的選擇性和靈敏度、分析過程簡(jiǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，有很大的發(fā)展前景[1]。酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是將免疫技術(shù)與現(xiàn)代測(cè)試手段相結(jié)合而建立的一種超微量的測(cè)定技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域。ELISA檢測(cè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、前處理簡(jiǎn)化、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、敏感、成本低、容量大，并可同時(shí)進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，這種學(xué)科交叉技術(shù)正逐漸成為獸藥殘留檢測(cè)的一個(gè)熱點(diǎn)。

1 獸藥殘留ELISA檢測(cè)技術(shù)的概述

ELISA是在熒光免疫和放射免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來的一種檢測(cè)技術(shù)，采用現(xiàn)代光學(xué)分析儀器進(jìn)行光度測(cè)定。測(cè)定時(shí)用固相載體吸附抗體（抗原），加待測(cè)抗原（抗體），再與相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體（抗原）進(jìn)行抗原抗體的特異免疫反應(yīng)，生成抗體（抗原）-待測(cè)抗原（抗體）-酶標(biāo)記抗體（抗原）的復(fù)合物，最后再與該酶的底物發(fā)生反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物，待測(cè)抗原（抗體）的定量與有色產(chǎn)物量成正比，因此可根據(jù)吸光值計(jì)算抗原或抗體的量，不僅可以定性分析而且可以進(jìn)行定量分析。

ELISA方法是用酶標(biāo)記抗原、半抗原或抗體而建立的方法，其分類至今無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，常用的方法有：雙抗體夾心法測(cè)抗原、酶標(biāo)抗原直接競(jìng)爭(zhēng)抑制法、酶標(biāo)抗體直接競(jìng)爭(zhēng)抑制法、酶標(biāo)抗體間接競(jìng)爭(zhēng)抑制法。在獸藥殘留檢測(cè)中一般采用間接法測(cè)抗體效價(jià)，評(píng)價(jià)抗體質(zhì)量，用競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定樣品中獸藥殘留量，其中酶標(biāo)抗體間接競(jìng)爭(zhēng)抑制法有商品化的酶標(biāo)二抗，無需自己制備，而被廣泛采用。

2 ELISA應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)技術(shù)

2.1 免疫抗原的合成

抗原是指一種能刺激人或動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。抗原的基本能力是免疫原性和反應(yīng)原性。免疫原性又稱為抗原性，是指能夠刺激機(jī)體形成特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。反應(yīng)原性是指能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)。具備免疫原性和反應(yīng)原性兩種能力的物質(zhì)稱為完全抗原。只具有反應(yīng)原性而沒有免疫原性的物質(zhì)，稱為半抗原。半抗原沒有免疫原性，不會(huì)引起免疫反應(yīng)。但在某些特殊情況下，如果半抗原和大分子蛋白質(zhì)結(jié)合以后，就獲得了免疫原性而變成完全抗原，也就可以刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體和效應(yīng)細(xì)胞。

抗原的免疫原性與分子量直接相關(guān)。一般分子量越大、分子結(jié)構(gòu)越復(fù)雜則免疫原性越強(qiáng)。獸藥大多是小分子物質(zhì)，屬于半抗原，因此通常要與分子量較大的載體（一般為蛋白質(zhì)）偶聯(lián)，形成獸藥——載體蛋白結(jié)合物免疫原，即形成完全抗原。相同大小的分子，如果化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象不同，其免疫原性也有差異。一般來說，分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象愈復(fù)雜的物質(zhì)免疫原性愈強(qiáng)。所以，免疫半抗原的結(jié)構(gòu)是否合理，關(guān)系到能否制備穩(wěn)定并有良好免疫原性的人工免疫原，也是獸藥殘留ELISA方法建立的重要環(huán)節(jié)。理想的免疫半抗原一方面應(yīng)盡量具備與待測(cè)物有類似的化學(xué)特征，另一方面與載體連接后應(yīng)盡量保證該特征結(jié)構(gòu)最大程度地被免疫活性細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合，以制備出具有預(yù)期選擇性和親和性的抗體。有些待測(cè)獸藥殘留物可直接作為免疫半抗原，與載體偶聯(lián)，但對(duì)多數(shù)不具備活性基團(tuán)的獸藥可進(jìn)行衍生化制備或由原料合成，也可用其他代謝及降解產(chǎn)物作為免疫半抗原。

完全抗原的制備是將免疫半抗原活化后，在偶聯(lián)劑作用下與載體蛋白偶聯(lián)。常用的載體蛋白質(zhì)有牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）、人血清蛋白（HAS）、結(jié)核桿菌毒素蛋白（TT）、多聚賴氨酸（PLL）。目前，用的最多的是BSA，因?yàn)槠湮锘再|(zhì)穩(wěn)定、不易變性、價(jià)廉易得，而且賴氨酸含量高，自由氨基多，在不同的pH和離子強(qiáng)度下均有較大的溶解度，在含有有機(jī)溶劑（如吡啶、N，N-二甲基甲酰胺）情況下均可和免疫半抗原進(jìn)行偶聯(lián)，且在偶聯(lián)后仍保持可溶狀態(tài)[2]。

有時(shí)為了提高抗體效價(jià)和特異性，通常需要在半抗原與載體間引入一定長(zhǎng)度的間隔分子（又稱“間隔臂”），目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，較適宜的間隔臂長(zhǎng)度為4～6個(gè)碳鏈長(zhǎng)度（0.5～0.8 nm），能較好的突出與載體結(jié)合后抗原分子表面上具有特征立體結(jié)構(gòu)和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)即抗原決定簇。間隔臂應(yīng)是不會(huì)改變半抗原的電子分布的吸電子基團(tuán)或雜環(huán)，應(yīng)為非極性，除供偶聯(lián)的活性基團(tuán)外不應(yīng)有其他高免疫活性的結(jié)構(gòu)，以減少抗體對(duì)間隔臂的識(shí)別[3]。

2.3 獸藥抗體的制備

一般可采用兩種途徑產(chǎn)生抗體：一是多克隆抗體技術(shù)，二是雜交瘤單克隆抗體技術(shù)。多克隆抗體可用獸藥-載體蛋白結(jié)合物直接免疫兔子等動(dòng)物，從被免疫的動(dòng)物血清中獲得，這種抗體不均一，來源間斷，有較大的批間差別，但用于免疫分析效果良好，技術(shù)成熟，目前絕大多數(shù)獸藥免疫分析仍采用多克隆抗體。單克隆抗體應(yīng)用于獸藥殘留分析的研究是從20世紀(jì)90年代開始的，近20年的發(fā)展國(guó)內(nèi)外已制備出十幾種獸藥的單克隆抗體，其中一些已應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)中[4]。單克隆抗體技術(shù)雖然生產(chǎn)成本高，技術(shù)復(fù)雜，但其特異性高，交叉反應(yīng)少，可大批量生產(chǎn)，成為獸藥殘留ELISA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

2.4 樣品的前處理

酶聯(lián)免疫吸附分析具有高選擇性、高靈敏度，一般僅需要簡(jiǎn)單提取，可使用稀釋樣品或提取液的方式減少基質(zhì)干擾。樣品提取溶劑需考慮其對(duì)免疫反應(yīng)和酶活性的影響，一般認(rèn)為，免疫分析的樣品溶液不能含有非水溶性溶劑，因?yàn)槠湫纬傻姆蔷嘟橘|(zhì)可干擾待測(cè)物自由擴(kuò)散或干擾與抗體結(jié)合。但也有人認(rèn)為，反應(yīng)介質(zhì)中適量水溶性有機(jī)溶劑存在，如甲醇、丙酮、二甲亞砜等，不僅可以簡(jiǎn)化操作，而且能增加脂溶性獸藥在介質(zhì)中溶解，降低其在實(shí)驗(yàn)器皿表面的吸附損失和破壞樣品基質(zhì)的親脂性膠束[5]。

3 ELISA檢測(cè)技術(shù)在獸藥殘留分析中的應(yīng)用

隨著小分子化合物免疫分析技術(shù)的發(fā)展，目前幾乎所有常見的獸藥殘留都已建立了ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)樣本多樣，主要有動(dòng)物組織（包括肌肉、肝臟、腎臟等）、蛋、乳、蜂蜜、飼料、尿液、毛發(fā)等。獸藥種類繁多，按用途分類主要包括：抗生素類、合成抗菌素類、抗寄生蟲藥、殺蟲劑和促生長(zhǎng)劑，抗生素和合成抗菌素合稱抗微生物藥物，是最主要的獸藥殘留藥物，約占60%[6-10]。表1列出了近3年（2010至2013年）國(guó)內(nèi)外有關(guān)抗微生物類獸藥殘留ELISA檢測(cè)方法的檢測(cè)樣本、檢測(cè)限和獸藥種類等情況。

4 問題和展望

獸藥殘留的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已經(jīng)取得了可喜進(jìn)展，但由于獸藥種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、檢測(cè)樣本各異，該技術(shù)的研究和開發(fā)應(yīng)用仍存在很多尚待解決的問題，如人工免疫抗原的合成、免疫反應(yīng)的特異性和抗體的選擇性、方法的標(biāo)準(zhǔn)化等[11-19]。但免疫分析技術(shù)的自身優(yōu)勢(shì)和方法上的不斷完善，尤其是制備更加特異的單克隆抗體或功能更加完備的重組單鏈抗體，以及免疫傳感器技術(shù)和芯片技術(shù)的日益完善，必將在獸藥殘留快速檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮愈來愈重要的作用。

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