UPLC法測定蠶用甲醛溶液中甲醛的含量

【摘要】建立超高效液相色譜法測定蠶用甲醛溶液中甲醛含量的方法。方法：采用反向高效液相色譜法，ACQUITY UPLC? HSS T3色譜柱，以35：65比例的甲醇和水為流動相，流速0.4ml·min-1，檢測波長為348 nm，測定蠶用甲醛溶液中甲醛的含量，并將其與傳統容量法結果進行比較。結果：甲醛在濃度0.5μg·ml-1～40μg·ml-1范圍內的線性良好，相關系數r為0.9999，含量平均值和容量法進行比較，相對偏差在1.0%以內，結果無顯著差異。結論：本方法操作簡便、靈敏度高、重現性好，可作為蠶用甲醛溶液的質量控制方法。

【關鍵詞】蠶用甲醛溶液；超高效液相色譜法；甲醛；含量測定

甲醛（HCHO）是揮發性有機化合物，是一種原生質毒，對眼部及呼吸、神經和內分泌等系統有毒害性，此外還有致癌、致突變的遺傳效應。但由于其親水性好、殺菌率高、價格低廉以及不受體系中酸堿度影響等優點，常用作消毒劑和防腐劑[1]。蠶用甲醛溶液為消毒藥，能使微生物蛋白質凝固變性，使病原微生物死亡，用于蠶室、蠶具和卵面消毒。蠶用甲醛溶液收載于農業部1435號公告，標準采用容量法測定甲醛含量[2]。容量分析法（也稱滴定法），是將已知濃度的滴定液由滴定管滴加到被測藥物的溶液中，直至滴定液與被測藥物反應完全（通過適當方法指示），然后根據滴定液的濃度和被消耗的體積，按化學計量關系計算出被測藥物的含量。容量分析法所用儀器價廉易得，操作簡便、快速，方法耐用性高，測定結果準確，通常情況下其相對誤差在0.2%以下，被廣泛應用于化學原料藥的含量測定，但該法的專屬性（選擇性）較差。因此，研究并建立一種高效、準確的超高效液相色譜法測定蠶用甲醛溶液的含量有重要意義。本文建立的方法操作簡便，靈敏度高，重現性好，為蠶用甲醛溶液的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters ACQUITYTM超高效液相色譜儀，配TUV檢測器；AG-285電子天平（Mettler公司）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。

水中甲醛溶液標準物質為中國計量科學研究院，批號為12002，純度為10.1 mg·ml-1；甲醛-2，4-二硝基苯腙標準品為AccuStandard公司產品，批號為212101191，純度為0.1 mg·ml-1；2，4-二硝基苯肼為國藥集團化學試劑有限公司產品，為分析純，批號為F20090410；鹽酸，為分析純，杭州化學試劑有限公司產品，批號20120906，純度為36.0%～38.0%；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 液相方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC? HSS T3 1.8μm，2.1mm×100 mm；檢測波長：348 nm；進樣量：5μL；流動相：甲醇-水（35：65）；柱溫：30℃；流速：0.4 ml·min-1。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取甲醛溶液（蠶用）0.3 g，置100ml量瓶中，用水稀釋至刻度；取1.00 ml置100 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，為含甲醛約為10μg·ml-1的溶液。

2.1.3 衍生化試劑制備

稱取2，4-二硝基苯肼100 mg，溶解于24 ml鹽酸中，加水稀釋至100 ml[2，3]。

2.1.4 標準工作液制備

精密量取水中甲醛溶液標準物質1ml置100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，濃度為101μg·ml-1。

2.1.5 衍生化反應

取甲醛對照品溶液供試品溶液5.00ml，置10ml具塞比色管中，加入2ml衍生化溶液和3ml乙腈，置60℃水浴中20min，快速冷卻，UPLC分析測定。

2.1.6 線性關系考察

分別吸取一定量的標準工作液，用水稀釋成濃度為0.5μg·ml-1～40μg·ml-1的標準系列工作溶液，臨用新配。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=2.90×105X+5.91×104，相關系數r為0.9999，表明甲醛在濃度0.5μg·ml-1～40μg·ml-1范圍內的線性良好。

圖1 甲醛對照品標準曲線

2.1.7 精密度試驗

吸取20μg·ml-1的甲醛標準溶液衍生化后的溶液，連續進樣5次，測定峰面積，結果RSD為0.3%，表明精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗

取精密度試驗的溶液，分別在放置0h、2h、4h、6h、8 h再進樣測定，RSD為0.5%，表明穩定性良好。

2.1.9 專屬性試驗

取對照品溶液、供試品溶液與陰性樣品，分別進樣測定。供試品與對照品在同一保留時間有相同的峰出現，而陰性樣品則無相應的峰（見圖2，3，4）。

圖2 甲醛對照品溶液的超高效液相色譜圖

圖3 甲醛對照品溶液的超高效液相色譜圖

圖4 甲醛供試品溶液的超高效液相色譜圖

2.2 容量法

取本品約1. 5ml，精密稱定，加水10ml、過氧化氫試液25ml與溴麝香草酚藍指示液2滴，滴加氫氧化鈉滴定液（1 mol/L）至溶液顯藍色；再精密加氫氧化鈉滴定液（1 mol/L）25ml，瓶口置一玻璃小漏斗，置水浴上加熱15min，不時振搖，放冷，用水洗滌漏斗，加溴麝香草酚藍指示液2滴，用鹽酸滴定液（1 mol/L）滴定至溶液顯黃色，并將滴定的結果用空白試驗校正。每1 ml氫氧化鈉滴定液（1 mol/L）相當于30.03mg的CH2O。

2.3 結果比較

以建立的UPLC法測定蠶用甲醛溶液中甲醛的含量和容量法測定的進行比較，結果含量平均值的相對偏差在1.0%以內，結果無顯著差異。

表1 UPLC與容量法測定甲醛溶液（蠶用）含量結果比較

批 號201205012012050220120503

UPLC（%）37.137.837.6

容量法（%）37.538.237.8

相對偏差（%）0.50.40.3

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

查閱文獻可知，甲醛和衍生化溶液反應，生成甲醛-2，4-二硝基苯腙，為了確定最佳檢測波長，我們采用紫外分光光度法對最佳檢測波長進行了考察。用甲醇溶解甲醛-2，4-二硝基苯腙對照品并稀釋至5μg·ml-1，參照紫外可見分光光度法，在200nm～400nm的波長范圍進行掃描，在348nm的波長處有最大吸收（見圖5）。因此，我們選擇348nm作為檢測波長。

圖5 甲醛-2，4-二硝基苯腙對照品溶液的紫外光吸收譜圖

3.2 流動相的選擇

超高效液相色譜柱ACQUITY uplc? HSST3 1.8μm 2.1mm×100mm，可以對甲醛進行分離，以比例為35：65的甲醇和水作為流動相時[4]，甲醛峰形較好，沒有干擾，保留時間3.00min，滿足檢測要求。

3.3 衍生反應條件的確定

考察了衍生反應溫度、衍生劑用量、反應時間等因素的影響[5]。分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下進行衍生反應，產物經UPLC檢測，發現60℃下衍生物的峰面積達到最大；分別加入0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml衍生化試劑進行反應，峰面積在2.0ml達到最大；分別對衍生時間為10min、20min、30min、40min、50min、60min時的色譜峰面積進行考察，發現在20min內反應完全，色譜峰面積達到最大。因此，選擇衍生化試劑用量2ml、水浴溫度60℃和水浴時間20min。

參考文獻

[1]方桂紅，徐莉，紀少凡.超高液相色譜法測定食品中甲醛含量[J].食品研究與開發，2012，33（9）：154-156.

[2]獸藥國家標準匯編（第一冊）[S].124-125.

[3]韓軍，花卉，馮立.超高效液相色譜法測定皮革中甲醛含量[J].西部皮革，2010，32（9）：26-28.

[4]佟琦，王志斌，崔?，?，等.高效液相色譜法對粉條中甲醛含量的快速檢[J].分析測試學報，2011，30（12）：1392-1395.

[5]韓軍，花卉，馮立.超高效液相色譜法測定皮革中甲醛含量[J].西部皮革，2010，32（9）：26-28.