二氫楊梅素對H2O2誘導人臍靜脈內皮細胞氧化損傷的影響

劉云霄，潘曉瓊，胡臻

（溫州醫科大學附屬第二醫院 中醫科，浙江 溫州 325027）

藤茶作為一種民間古茶，可追溯至東晉時期[1]。目前，在我國廣大農村，甚至在東南亞各國也享有盛譽。民間主要用以治療糖尿病等多種疾病。現代研究表明，藤茶中主要含有黃酮類成分，以二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）含量最高，具有消炎抗菌、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、保肝[4]、護胃[5]、降血糖[6]等作用。糖尿病以高血糖為主要特征，逐漸損傷血管和器官，最終出現威脅生命的并發癥。在這些并發癥的病理生理中，微小血管的改變起到十分重要的作用[7]。以往動物實驗證實DMY具有降血糖、抗氧化作用，但缺乏對人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）的研究報道。本實驗以體外培養HUVECs為基礎，通過觀察DMY對過氧化氫（H2O2）誘導的HUVECs損傷的作用，明確DMY對糖尿病血管內皮細胞的影響，并初步探討其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和試劑：HUVECs由中國科學院細胞庫提供。胎牛血清、PRMI1640培養液、0.25%胰酶-EDTA為Gibco公司產品，青/鏈霉素、活性氧（ROS）、細胞內鈣離子（Ca2+）、細胞凋亡-Hoechst33258染色試劑盒購于碧云天，MTT為sigma公司產品，DMY購于成都曼思特公司，D-葡萄糖為biosharp公司產品，超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、微量丙二醛（MDA）測試盒購于南京建成。

1.1.2 儀器：CO2細胞培養箱，多功能酶標儀，細胞工作超凈臺，低速離心機，倒置顯微鏡，流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞株的培養：HUVECs復蘇后，用含有10%胎牛血清的1640培養液置于37 ℃、5% CO2、相對濕度為95%培養箱里培養，隔天傳代。取對數生長期的細胞用于本次實驗研究。

1.2.2 實驗分組：用不同濃度DMY（5μg·mL-1，20μg·mL-1，80μg·mL-1）預處理保護HUVECs 12 h，分別為DMY低、中、高劑量組，再用0.5 mmol·L-1H2O2[8]干預12 h后進行相應的處理。

1.2.3 Hoechst33258染色觀察細胞核形態變化：按試劑盒說明書操作。

1.2.4 取上清液檢測SOD、MDA：按說明書操作，分別于多功能酶標儀波長為550 nm、532 nm處，測各管SOD、MDA吸光度。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞內ROS和細胞內Ca2+的變化情況：分別按試劑盒說明書處理后，避光保存，送流式細胞儀檢測。

1.3 統計學處理方法 應用SPSS17.0統計學軟件進行統計分析。所有數據均以 ±s表示，采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T3。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同處理因素對HUVECs活力的影響 與正常組相比，每組差異均有統計學意義（P＜0.05），其中DMY濃度與HUVECs細胞活性呈負相關，以5μg·mL-1保護作用最明顯。DMY 80μg·mL-1時細胞活力反低于H2O2組，可能與細胞不能耐受高濃度的DMY及高濃度存在細胞毒性有關。見表1。

表1 不同處理因素對HUVECs活力的影響（n=15，±s）

2.2 Hoechst33258進行細胞核染色 正常HUVECs核呈彌散均勻低強度藍色熒光，胞核較大，形態規則，呈圓形或者橢圓形狀。H2O2組細胞核呈集中高強度藍色熒光，偶有些顏色發白，胞核較小，形態不規則，呈固縮致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，出現細胞凋亡。DMY（低、中、高劑量）組細胞核熒光強度隨濃度增加而增加，胞核由低強度逐漸趨于高強度熒光，形狀由規則圓形或者橢圓形逐漸呈不規則固縮致密濃染化，細胞數逐漸減少，見圖1。以上表明，DMY對H2O2誘導HUVECs損傷起保護作用，且呈劑量負相關性，其最佳藥物濃度為5μg·mL-1。

2.3 DMY組能顯著增加上清液SOD活性，降低MDA含量 與正常組相比，H2O2誘導HUVECs出現SOD活性下降，MDA含量升高，引起氧化損傷。DMY增強清除自由基的能力，減少過氧化作用的發生，增強抗氧化能力，從而起保護細胞的作用，以5μg·mL-1DMY低劑量組尤為明顯。見表2。

圖1 不同濃度DMY對H2O2誘導HUVECs細胞核形態學比較（×400）

2.4 流式細胞儀檢測細胞內ROS和Ca2+濃度 與正常組相比，H2O2引起HUVECs出現細胞內ROS和Ca2+積累，兩者呈正相關性，導致細胞凋亡。DMY為強抗氧劑，DCFH-DA探針對細胞內ROS反應較為敏感，故DMY（低、中、高劑量）組ROS量與DMY濃度呈正相關，DMY（低、中、高劑量）組ROS量反低于正常組。與正常組相比，DMY（中、高劑量）組細胞內Ca2+濃度差異有統計學意義（P＜0.05），但ROS水平差異無統計學意義（P＞0.05），故DMY（中、高劑量）組與正常組差異無統計學意義。總之，DMY低劑量組，能顯著下調細胞內ROS水平和Ca2+濃度，且差異有統計學意義（P＜0.05），故DMY低劑量組對H2O2誘導的細胞起最佳保護作用。見表3。

表2 DMY對細胞上清液SOD活性和MDA含量的影響（n=15，±s）

表3 DMY對細胞內ROS和Ca+濃度的影響（n=15，±s）

3 討論

目前全球糖尿病患病率呈明顯上升趨勢，預計到2030年將達5.52億。此外，在全球范圍內有糖尿病前兆、糖耐量受損、胰島β細胞功能失調人群，到2030年將達3.98億。目前認為糖尿病及其并發癥潛在的發生機制主要為氧化應激，內皮功能紊亂而引發糖尿病誘導血管性的疾病。研究表明內皮功能紊亂往往先于糖尿病臨床癥狀出現[9-10]。糖尿病對微小血管的損傷導致血管硬化損傷是不可逆的。因此，通過早期診斷和優化血糖控制以預防微小血管的損傷，減少并發癥[11]有著非常重要的作用。

SOD是細胞內重要的內源性抗氧化物酶，在人體內將超氧陰離子自由基轉化成H2O2，從而減少超氧陰離子與一氧化氮反應生成有活性的過氧硝酸鹽的可能性[12]，可間接反映細胞內的抗氧化水平的情況。MDA是細胞內自由基作用于多不飽和脂肪酸發生過氧化反應后的產物，可間接反映脂質過氧化水平的情況[13]。由于SOD和MDA都是氧化損傷在不同層次上的反應，他們之間的表現有一致性。

ROS在糖尿病的發病和血管功能障礙的發展中扮演重要的角色。在糖尿病并發癥的靶細胞里發現線粒體ROS生成增加[14]。而細胞內的Ca2+是細胞內重要的第二信使，鈣穩態是細胞正常存在的基礎。本研究使用H2O2模擬糖尿病內皮細胞損傷模型，H2O2具有強氧化性，低濃度可導致正常細胞出現凋亡，高濃度則出現壞死。H2O2引起細胞損傷的關鍵在于通過Ca2+作為第二信號，引發一系列細胞程序化死亡的信號傳導。ROS對細胞內Ca2+有一定的調控作用。當Ca2+濃度升高超過正常細胞內Ca2+的閾值，Ca2+濃度升高可促進胞內ROS堆積，反之亦然，兩者在細胞凋亡中起重要作用。

氧化應激的預防機制，有助于減少ROS的代謝產物及其衍生物的形成，包括SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和過氧化氫酶（CAT）等。這些抗氧化酶水平影響各種組織氧化應激的敏感性和糖尿病并發癥的發生。糖尿病的發生會增加脂質過氧化反應的敏感性，這是導致糖尿病并發癥的形成的重要原因。DMY是一種具有抗氧化、抗感染等功效的黃酮類化合物。目前鮮有有關從細胞學角度出發探討DMY對糖尿病的研究報道。本實驗研究DMY對H2O2誘導HUVECs的保護作用及其相關機制，證實DMY能增強細胞內SOD活性，降低MDA含量，通過降低細胞內ROS、Ca2+從而對HUVECs起保護作用，以低濃度5μg·mL-1DMY時效果最佳。關于其最佳保護藥物濃度，筆者認為濃度越高，超過細胞本身負荷的能力，反造成細胞代謝的負擔，產生細胞毒性。不同于DMY對抑制腫瘤細胞的增殖，出現劑量依賴性，濃度越高，抗腫瘤越強[15]。

[1] 陳緒維, 董柏平, 陳介眉, 等. 藤茶飲用藥用價值研究[J]. 湖南農業科學, 2007(6): 180-181.

[2] 吳明彩, 蔣明, 畢富勇. 二氫楊梅素聯合絲裂霉素對胃癌細胞的生長抑制作用[J]. 中國病理生理雜志. 2011, 27(7): 1424-1427.

[3] 張志堅, 張曉元, 李國林, 等. 二氫楊梅素對細胞等氧化傷害時的保護作用[J]. 湖南師范大學自然科學學報, 2007, 30(2): 99-102.

[4] 蘇東林, 黃繼紅, 姚茂君. 二氫楊梅素的急性毒理學評價及對酒精性肝損傷的防治效果[J]. 湖南農業科學, 2009(11): 90-93.

[5] 陳立峰, 張瓊, 董倩倩. 二氫楊梅素對大鼠免疫性慢性胃炎胃粘膜的保護作用及其機制[J]. 中國藥理學與毒理學雜志,2009, 23(5): 381-387.

[6] 盧威, 秦曉改, 王躍虎, 等. 二氫楊梅素對四氧嘧啶性糖尿病小鼠的降糖作用研究[J]. 中藥藥理與臨床, 2011, 27(4): 15-17.

[7] Barregard L. Cardiovascular disease and diabetes-effects of methyl mercury, cadmium, and lead[J]. Toxicology letters,2012, 211: S12.

[8] 王浩. 過氧化氫誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡時PPARβ表達及活性變化[D]. 中南大學, 2010: 1-36.

[9] Hemmingsen B, Lund SS, Gluud C, et al. Intensive glycaemic control for patients with type 2 diabetes: systematic review with meta-analysis and trial sequential analysis of randomized clinical trials[J]. BMJ, 2011, 343: 6898.

[10] Yudkin JS, Lipska KJ. Hard end points are needed for intensive glycaemic control in patients with type 2 diabetes[J].BMJ, 2012, 344: e708.

[11] Sawicki PT. Screening for diabetes: hope and despair[J].Diabetologia, 2012, 55(6): 1568-1571.

[12] Piconi L, Quagliaro L, Assaloni R, et al. Constant and intermittent high glucose enhances endothelial cell apoptosis through mitochondrial superoxide overproduction[J]. Diabetes, 2006, 22(3): 198-203.

[13]Zhao Y, Lu N, Li H, et al. High glucose induced human umbilical vein endothelial cell injury: involvement of protein tyrosine nitration[J]. Mol Cell Biochem, 2008, 311(1-2): 19-29.

[14]Yao D, Brownlee M. Hyperglycemia-Induced Reactive Oxygen Species Increase expression of the receptor for advanced glycation end products (RAGE) and RAGE ligands[J].Diabetes, 2010, 59(1): 249-255.

[15] 尹梅梅, 潘振偉, 蔡本志, 等. 二氫楊梅素誘導人肺癌腺細胞系AGZY-83-a凋亡的實驗研究[J]. 中國藥理學通報, 2008,24(5): 626-630.