信號素4D影響直腸癌裸鼠移植瘤的血管新生*

丁曉潔 李 多 黃新偉 付娟娟 潘 玥 陳俊英孫強明

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，西方國家發(fā)病率較高，死亡率可達33%，在發(fā)達國家位居癌癥死亡率第二位［1-2］。在東南亞也是位居第四的常見惡性腫瘤［3］。隨著人口老齡化、生活水平和飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)直腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢［4］。

實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴血管新生，以保證向快速分裂的惡性細胞運輸氧氣、養(yǎng)分并清除代謝廢物。因此，通過抑制新血管生成，切斷腫瘤血供，抑制腫瘤生長、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，代表了近年來治療腫瘤的新策略［5］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體（VEGFR）因其在腫瘤血管生成中的重要作用，已成為抗腫瘤生物治療的一個重要靶點。然而，anti-VEGF治療的效果在直腸癌患者中表現(xiàn)出較大的個體差異性，并且腫瘤細胞對anti-VEGF治療已逐漸產(chǎn)生抗性［6-7］，目前對于腫瘤抗anti-VEGF治療的機制研究尚不夠深入。

腫瘤介導(dǎo)血管生成的信號傳導(dǎo)是一個復(fù)雜的、多因素網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，當(dāng)一條信號通路被抑制后，腫瘤可能啟動一條或多條血管新生補救途徑。信號素（Semaphorins）和其受體神經(jīng)叢素（Plexins）作為神經(jīng)系統(tǒng)中軸突導(dǎo)向分子而被發(fā)現(xiàn)。在個體發(fā)育過程中，血管新生和神經(jīng)系統(tǒng)的生長非常相似。有研究證明，信號素4D（Sema4D）通過其受體神經(jīng)叢素-B1（Plexin-B1）能誘導(dǎo)血管生成［8］。Sema4D 是一個150kD的跨膜糖蛋白，在某些類型的腫瘤中高表達［9］。其受體Plexin-B1表達于血管內(nèi)皮細胞表面［8］。推測在一些腫瘤中，Sema4D和VEGF在誘導(dǎo)血管新生應(yīng)答方面有非常相似的作用，干擾Sema4D信號通路將可能通過抑制血管新生來減緩腫瘤生長。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒包裝細胞293T，直腸癌細胞株HCT-116，人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所保存；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hylcone公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；聚凝胺polybrene購自美國Sigma公司；Western底物購自美國Millipore公司；Matrigel購自美國BD Biosciences公司；Transwell嵌套（8 μm孔徑）購自美國Corning公司；BCA試劑盒及HRP-DAB顯色試劑盒購自北京TIANGEN公司；SPF級BALB/c裸鼠6只，4～5周齡雌性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001；Gateway慢病毒包裝系統(tǒng)來自美國馬里蘭大學(xué)John Basile博士的惠贈；小鼠抗人Sema4D購自美國BD公司；小鼠抗人β-actin購自美國Santa Cruz公司；羊抗小鼠IgG，HRP標(biāo)記購自美國KPL公司；大鼠抗小鼠CD31購自美國BD公司；Dylight 488羊抗大鼠IgG購自美國Jackson公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) DMEM含10%FBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒包裝 將6×106個293T細胞，鋪到10 cm2培養(yǎng)皿中，待細胞融合度達70%～80%。將pVSVG包膜質(zhì)粒，pSPAX結(jié)構(gòu)質(zhì)粒及PWPI Sema4D shRNA干擾質(zhì)粒或PWPI eGFP對照慢病毒質(zhì)粒按比例混合，依操作說明與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000混勻，轉(zhuǎn)染293T細胞。24 h后換培養(yǎng)基，隨后的48、72 h收獲含慢病毒的上清，-80℃保存。

1.2.3 用重組慢病毒感染目的細胞 慢病毒培養(yǎng)上清于冰上化凍，與完全培養(yǎng)基等體積混勻，加polybrene至8 μg/mL。HCT-116達到60%融合度時感染，過夜更換培養(yǎng)基。感染72 h收獲細胞，取樣用于Western blot檢測，其余用于后續(xù)實驗。

1.2.4 Western blot 提細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整一致，樣品經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗（1:1 000）分別為：小鼠抗人Sema4D、小鼠抗人β-actin 4℃孵育過夜，二抗羊抗小鼠IgG（1:5 000）37℃ 1 h，暗室顯影。

1.2.5 Transwell遷移實驗 經(jīng)對照組和干擾組HCT-116細胞處理的無血清DMEM作誘導(dǎo)物，陽性對照：DMEM含10%FBS；陰性對照：無血清DMEM。HUVEC細胞懸于無血清DMEM作為遷移細胞，約1×106個/mL。每組4孔培養(yǎng)10h取出固定、HE染色。膜掃描后用NIH Image軟件分析不同實驗組HUVEC細胞遷移率。

1.2.6 移植瘤模型的建立 消化對照慢病毒和干擾慢病毒感染的直腸癌細胞，無血清DMEM重懸為1×107/mL，與等體積Matrigel在冰上混勻。對照組和干擾組分別接種于裸鼠左、右側(cè)腋窩皮下，含細胞2×106/側(cè)。每周測量瘤體長徑（a）和短徑（b），計算腫瘤體積（V），公式V=ab2/2。

1.2.7 免疫組織化學(xué)檢測Sema4D水平 取出移植瘤，固定包埋。石蠟切片經(jīng)脫蠟水化，抗原修復(fù)。1%BSA 37℃封閉1 h，一抗小鼠抗人SEMA4D（1:100）37℃ 1 h，二抗羊抗小鼠IgG（1:200）37℃ 1 h，顯色。

1.2.8 免疫熒光檢測血管生成情況 CD31作為內(nèi)皮細胞標(biāo)記，廣泛用于評估血管生成。移植瘤做8 μm冰凍切片，4%中性甲醛固定10 min。1%BSA 37℃封閉1 h，一抗大鼠抗小鼠CD31（1:100稀釋）37℃ 1 h，二抗羊抗大鼠IgG（1:200）避光37℃1 h，熒光顯微鏡觀察。每組選12張切片，每個移植瘤至少一張，其余隨機。用NIH Image軟件分析比較2組照片中的血管密度。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒感染能有效干擾細胞Sema4D的表達

慢病毒感染能夠使外源片段整合到宿主細胞的染色體上，實現(xiàn)長期穩(wěn)定的表達。而由于外源片段插入的隨機性，慢病毒感染的效果需要驗證。Western blot檢測證實：在細胞總蛋白濃度一致的前提下，Sema4D在不感染組與對照病毒感染組間無明顯差異，而干擾組則顯著下調(diào)（圖1）。說明Sema4D shRNA慢病毒感染直腸癌細胞HCT-116，特異性的干擾Sema4D的表達，而對照慢病毒對目的蛋白水平無明顯影響。

2.2 Transwell結(jié)果顯示干擾Sema4D減弱靶細胞誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移的能力

Sema4D經(jīng)基質(zhì)金屬蛋白酶剪切，其胞外部分釋放到環(huán)境中，與血管內(nèi)皮細胞上的受體結(jié)合，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞遷移［10］。血管內(nèi)皮細胞運動遷移是血管形成過程的關(guān)鍵步驟之一。結(jié)果顯示下調(diào)Sema4D表達量的HCT-116誘導(dǎo)HUVEC遷移的能力減弱，略高于陰性對照（圖2）。

2.3 移植瘤模型顯示干擾Sema4D的表達能減緩裸鼠皮下移植瘤生長的速度

接種細胞1周后對照組皮下可見明顯瘤塊，瘤體近圓形或橢圓形，有不規(guī)則凹凸。移植瘤表面血管豐富，無潰瘍出現(xiàn)。干擾組在3～4周可陸續(xù)觀察到大小不等的瘤塊。30 d收獲移植瘤，接種成功率100%。對照組血供豐富且瘤體和周圍的組織發(fā)生粘連較重，而干擾組相對血供較少。同一宿主的移植瘤，對照組比干擾組更有競爭優(yōu)勢，二者差異表達的基因Sema4D可能在這一競爭優(yōu)勢的差異上有所貢獻。誘導(dǎo)血管新生的能力是移植瘤競爭優(yōu)勢中的一個重要指標(biāo)，因為在體內(nèi)癌細胞的養(yǎng)分主要來自宿主血供。比較同一個宿主的2個移植瘤，對照組大于干擾組的現(xiàn)象很明顯；但是個別宿主的干擾組移植瘤也較大，接近某些宿主的對照組?？傮w上干擾組的生長速度和移植瘤體積依然明顯小于對照組。通過個體和整體兩方面比較，來衡量表達Sema4D對HCT-116細胞成瘤的貢獻（圖3，4）。

2.4 慢病毒感染穩(wěn)定干擾移植瘤中Sema4D的表達

免疫組織化學(xué)染色顯示：移植瘤中對照組Sema4D表達水平高于干擾組。慢病毒不僅有效抑制了目的蛋白在細胞系中的表達，也能穩(wěn)定降低其在移植瘤中的表達水平（圖5）。進一步驗證了慢病毒載體能夠?qū)崿F(xiàn)持久穩(wěn)定的干擾。

2.5 干擾Sema4D的表達能降低移植瘤內(nèi)血管密度

免疫熒光顯示：對照組瘤內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)豐富，血管形態(tài)不規(guī)則，干擾組瘤內(nèi)血管較稀少。通過相對熒光強度比較，干擾組血管密度比對照組低約40%（圖5）。瘤內(nèi)血管密度代表了所有血管新生調(diào)節(jié)因子和信號通路的效應(yīng)總和，比單獨檢測一個生長因子或信號通路更能反映實際情況。因此也是衡量腫瘤血管新生功能的常用指標(biāo)，有研究顯示腫瘤微血管密度與患者預(yù)后有一定相關(guān)性［11］。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的HCT-116（×100）Figure 1 HCT-116 infected by lentivirus（×100）

圖2 Transwell遷移實驗（×100）Figure 2 Migration assay

圖3 移植瘤生長曲線Figure 3 Growth curves of the transplanted tumors

圖4 荷瘤裸鼠及2組移植瘤Figure 4 Tumor-bearing nude mouse and colorectal cancer xenografts

圖5 免疫組織化學(xué)檢測2組移植瘤中Sema4D的表達（×200）及免疫熒光檢測血管密度（×200）Figure 5 Immunohistochemistry analysis for Sema4D and immunofluorescence for vascular density×200

3 討論

抗血管生成療法以促血管新生信號分子為靶點，機制應(yīng)包括阻斷新血管網(wǎng)絡(luò)的形成，調(diào)整已有供血網(wǎng)絡(luò)，重塑血管壁，降低腫瘤微血管密度、血管體積和血管網(wǎng)灌注量［5］。這一系列效應(yīng)減少向癌細胞輸送養(yǎng)分，從而抑制癌細胞增殖和腫瘤生長。同時，抗血管新生療法還可以減少無功能的瘤體血管，降低腫瘤組織間隙液壓，促進化療藥物更有效的輸送到腫瘤內(nèi)部，增進化療效果［12-13］。在實際治療中，許多化療藥物和抗血管生成的藥物聯(lián)合使用效果更佳。目前腫瘤治療中已有很多阻斷VEGF信號通路的策略，包括VEGF中和抗體，低分子量VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑（TKIs），可溶性VEGF陷阱（VEGF-Trap）等。其中貝伐單抗，靶分子為VEGF-A的重組人源化IgG1單克隆抗體，已成為治療轉(zhuǎn)移性直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)方案之一［5，12］。

在原有基礎(chǔ)上，進一步誘導(dǎo)并構(gòu)建新的血管網(wǎng)絡(luò)，保證腫瘤生長代謝所需的豐富血供為實體瘤生長的限速關(guān)卡［14］。瘤體缺氧微環(huán)境就是誘導(dǎo)血管新生的“開關(guān)”。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1是其中的一個核心調(diào)節(jié)元件。HIF-1是由α、β兩個亞基組成的二聚體，HIF-1β為組成型表達的核蛋白，HIF-1α則受微環(huán)境氧壓影響。在氧充足的條件下，HIF-1α經(jīng)脯氨酸羥化酶在Pro402或Pro564位羥基化后，與E3泛素連接酶作用而后經(jīng)蛋白酶體降解。由于HIF脯氨酸羥化酶活性依賴于Fe2+和O2，低氧水平會導(dǎo)致HIF-1α的累積并與HIF-1β組成有活性的二聚體，進而開啟下游一系列目的基因的轉(zhuǎn)錄。其中的一條重要通路包括VEGF及其受體家族成員。VEGF可由癌細胞或瘤體基質(zhì)細胞分泌，其中VEGF-A及其受體VEGFR-2被認為在調(diào)節(jié)血管新生方面起主要作用［15-16］。

血管新生是一個多因素共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程。在腫瘤血管生成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，抑制主要信號通路，將可能導(dǎo)致其他補救途徑的活化。進而引發(fā)針對治療的抗性，以及隨后的腫瘤再生長或復(fù)發(fā)［6］。其次，由于腫瘤誘導(dǎo)血管生成的過程有別于正常生理狀態(tài)下的血管新生，某些腫瘤誘導(dǎo)血管發(fā)生并不依賴于VEGF。臨床數(shù)據(jù)顯示，針對VEGF的抗血管新生治療僅在部分患者中顯示療效［7］。有研究表明［15，17］眾多分子參與調(diào)節(jié)不依賴于VEGF的血管新生信號通路，包括成纖維細胞生長因子（FGF）、白介素8（IL-8）、白介素1b（IL-1b）、表皮生長因子（EGF）、胰島素樣生長因子1（IGF-1）等，這一系列因素都可能影響腫瘤對anti-VEGF治療的敏感性。

多個國外科研小組包括本文的研究團隊均證實，腫瘤細胞表達的信號素4D（Sema4D）通過結(jié)合其位于血管內(nèi)皮細胞上的受體神經(jīng)叢素-B1（Plexin-B1），能誘導(dǎo)血管新生進而促進腫瘤生長［18-19］。臨床樣本顯示Sema4D在結(jié)直腸癌、頭頸鱗癌、前列腺癌、乳腺癌等多種癌組織中高表達［9］。已有研究通過體外和體內(nèi)試驗觀察：在VEGF通路被阻斷后，腫瘤細胞在缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）的調(diào)控下代償性地高表達Sema4D，在培養(yǎng)細胞和裸鼠體內(nèi)均表現(xiàn)出強烈的促血管新生功能，并且Sema4D和VEGF在誘導(dǎo)血管新生應(yīng)答方面有非常相似的作用［19］。由于Sema4D在誘導(dǎo)血管新生中的作用，干擾Sema4D信號通路將可能通過抑制血管新生來阻止腫瘤生長或轉(zhuǎn)移。臨床實際中采用多種藥物聯(lián)合化療，因為方案中的藥物搭配針對不同靶蛋白或信號通路，更能有效抑制癌細胞的增殖和腫瘤生長，同時也能盡量避免抗藥性的產(chǎn)生。在實際治療中，聯(lián)合使用多種抗血管新生藥物而非單一阻斷VEGF信號通路，或許是一種更為有價值的治療策略。

因此，根據(jù)每個腫瘤患者的實際情況，設(shè)計有針對性的個性化治療方案，或許是未來抗血管新生療法的發(fā)展方向。只有深入研究腫瘤細胞之間以及腫瘤細胞和宿主細胞之間的信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，才有可能通過對細胞間信號網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)影響腫瘤微環(huán)境，進而使腫瘤和宿主間的動態(tài)平衡向有利于宿主的方向偏移。研究結(jié)果將對改進靶向血管新生的腫瘤治療方案提供重要的理論和實踐依據(jù)。

1 Hoffman RM,Espey DK,Rhyne RL,et al.Colorectal cancer incidence and mortality disparities in new Mexico[J].J Cancer Epidemiol,2014,Epub2014 Jan 2.

2 Kekelidze M,D'Errico L,Pansini M,et al.Colorectal cancer:Current imaging methods and future perspectives for the diagnosis,staging and therapeutic response evaluation[J].World J Gastroenterol,2013,19(46):8502-8514.

3 Kokki I,Papana A,Campbell H,et al.Estimating the incidence of colorectal cancer in South East Asia[J].Croat Med J,2013,54(6):532-540.

4 Nimptsch K,Malik VS,Fung TT,et al.Dietary patterns during high school and risk of colorectal adenoma in a cohort of middle-aged women[J].Int J Cancer,2014,134(10):2458-2467.

5 Bellou S,Pentheroudakis G,Murphy C,et al.Anti-angiogenesis in cancer therapy:Hercules and hydra[J].Cancer Lett,2013,338(2):219-228.

6 Ellis LM,Hicklin DJ.Pathways mediating resistance to vascular endothelial growth factor-targeted therapy[J].Clin Cancer Res,2008,14(20):6371-6375.

7 Casanovas O,Hicklin DJ,Bergers G,et al.Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors[J].Cancer Cell,2005,8(4):299-309.

8 Basile JR,Barac A,Zhu T,et al.Class IV semaphorins promote angiogenesis by stimulating Rho-initiated pathways through plexin-B[J].Cancer Res,2004,64(15):5212-5224.

9 Basile JR,Castilho RM,Williams VP,et al.Semaphorin 4D provides a link between axon guidance processes and tumor-induced angiogenesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(24):9017-9022.

10 Basile JR,Holmbeck K,Bugge TH,et al.MT1-MMP controls tumor-induced angiogenesis through the release of semaphorin 4D[J].J Biol Chem,2007,282(9):6899-6905.

11 Pastushenko I,Vermeulen PB,Carapeto FJ,et al.Blood microvessel density,lymphatic microvessel density and lymphatic invasion in predicting melanoma metastases:systematic review and meta-analysis[J].Br J Dermatol,2014,170(1):66-77.

12 Gerger A,LaBonte M,Lenz HJ.Molecular predictors of response to antiangiogenic therapies[J].Cancer J,2011,17(2):134-141.

13 Jain RK,Duda DG,Clark JW,et al.Lessons from phase III clinical trials on anti-VEGF therapy for cancer[J].Nat Clin Pract Oncol,2006,3(1):24-40.

14 Moserle L,Casanovas O.Anti-angiogenesis and metastasis:a tumour and stromal cell alliance[J].J Intern Med,2013,273(2):128-137.

15 Pugh CW,Ratcliffe PJ.Regulation of angiogenesis by hypoxia:role of the HIF system[J].Nat Med,2003,9(6):677-684.

16 Shibuya M,Claesson-Welsh L.Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis[J].Exp Cell Res,2006,312(5):549-560.

17 Mizumaki Y,Jo WS,Duerr EM,et al.Induction of interleukin-8 preserves the angiogenic response in HIF-1 alpha-de fi cient colon cancer cells[J].Nat Rev,2005,11(9):992-997.

18 Zhou H,Yang YH,Binmadi NO,et al.The hypoxia-inducible factor-responsive proteins semaphorin 4D and vascular endothelial growth factor promote tumor growth and angiogenesis in oral squamous cell carcinoma[J].Exp Cell Res,2012,318(14):1685-1698.

19 Zhou H,Binmadi NO,Yang YH,et al.Semaphorin 4D cooperates with VEGF to promote angiogenesis and tumor progression[J].Angiogenesis,2012,15(3):391-407.