棉籽油中DNA不同提取方法的比較研究

付曉華 張 巖 張 薇 王 紅， 吳 濤 周 巍，3

棉籽油中DNA不同提取方法的比較研究

付曉華1張 巖2張 薇2王 紅1，2吳 濤2周 巍2，3

（河北師范大學生命科學院1，石家莊 050024）
（河北省食品安全監督檢驗研究院2，石家莊 050071）
（河北農業大學食品科技學院3，保定 071000）

在食用油DNA提取的SDS法和國標法基礎上，設計5種不同方案對15種來自不同生產廠家及加工精度的棉籽油進行DNA的抽提，通過比較各來源DNA提取液中內源基因tRNALeu的PCR擴增結果判斷DNA的提取效率；并對方案5獲得的DNA樣品進行外源基因FMV35S的PCR擴增以檢測轉基因成分。結果表明方案5提取棉籽油DNA的效率最高，而且方案5提取到的DNA能用于棉籽油的轉基因成分定性檢測。

棉籽油 DNA提取 富集 轉基因物種

食用油安全是人們健康生活的保證。棉籽油多以棉籽浸制而成，在人體內的消化吸收率可達98%，其亞油酸含量高（44.0%～55.0%），可有效抑制血液中的膽固醇；此外還含棕櫚酸、硬脂酸、油酸、花生酸等營養成分。過去由于粗制棉籽油中含有游離棉酚，限制了人們的大量食用。隨著加工工藝的改進，精制棉籽油將棉酚有效去除，棉籽油的市場占有率呈現增長趨勢。棉籽油已成為很多食用調和油的主要成分。

轉基因作物的種植率近年來不斷增加，轉基因食用油的市場占有率也越來越高。2002年，《農業轉基因生物標識管理辦法》中要求對上市的大豆油、玉米油、油菜籽油、棉花種子進行轉基因標識。2003年規定了對食用油脂中轉基因植物成分定性PCR檢測的方法［1-2］。這為油脂原料成分的鑒定和標簽標識檢驗提供了技術保證，對保護消費者權益和確保食品安全具有重要意義。

目前轉基因成分檢測主要依靠蛋白質檢測和核酸檢測兩方面。蛋白質檢測常規方法主要

有ELISA法，即酶聯免疫吸附測定法，其原理是利用表達的抗原與目標抗體間結合的特異性來檢測特定蛋白的存在。核酸檢測法則主要依賴聚合酶鏈式反應，其利用與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物對DNA序列進行檢測，具有更高的檢測靈敏度。由于特征基因已知，食用油脂中的轉基因植物成分定性檢測主要通過核酸檢測技術鑒定［3-13］。簡便高效的DNA提取方法，是進行核酸檢測和轉基因標簽鑒定的基礎。

DNA的提取方法已不斷深入，發展較成熟的DNA提取方法有硅藻土法、磁珠法、離心柱法和試劑盒法等［14］。梅玲玲等［15］用蛋白酶 K裂解法提取出多種食品中的轉基因成分，從中獲得高濃度的食用油 DNA提取液；程紅梅等［5］、袁建琴等［6］用中性磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和正己烷提取出大豆油中的DNA；楊冬燕等用CTAB直接抽提精煉植物油，得到了目的DNA。但由于精煉食用油中DNA含量本身很少，不能保證所有油中的DNA提取成功。因此，開發成本低、高效、穩定的方法是油類DNA檢測研究的重點。

目前DNA的常用提取試劑有SDS和CTAB 2種。本試驗用CTAB和SDS 2種常規提取液，采用5種方案對15種來自不同生產廠家及加工精度的棉籽油進行DNA的提取。通過擴增內源基因tRNALeu并進行瓊脂糖凝膠電泳，對各方案的DNA提取效率進行評價，以期獲得一種簡便高效的DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要試劑的配制

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、醋酸鈉（NaAc）：天津市博迪化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）：天津市科密歐化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）：北京拜爾迪生物公司；分析純級三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、無水乙醇、氯化鈉（NaCl）：天津市永大化學試劑有限公司；β-巰基乙醇：Amresco公司；100 bp DNA Ladder Marker，rTaq預混液、引物tRNALeu、FMV35S：大連寶生物技術公司合成。

擔體：本單位自提非轉基因大豆基因組DNA；TE緩沖液：Tris 0.010 mol／L，Na2EDTA 1.0 mmol／L，pH 8.0；CTAB提取液：CTAB 20 g／L，NaCl 1.4 mol／L，Tris 0.1 mol／L，Na2EDTA 0.02 mol／L，pH 8.0。

1.2 試驗材料與儀器

試驗儀器：恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；恒溫震蕩器：金壇市富華電器有限公司；MS3渦旋混勻器：IKA公司；水平電泳儀：北京市六一儀器廠；050-811 Tgradient96定性 PCR儀：Biometra TGradient公司；凝膠成像系統：Bio-Rad公司。

表1 棉籽油試驗材料

1.3 棉籽油DNA的提取

本試驗采用SDS和CTAB 2種常規提取液，以SDS法和國標法［1］為基礎，并對國標法進行優化，最終確立SDS法、國標法、大量富集法、直接裂解法、上清重復離心法5種方案。由于5種方案遵循共同的DNA提取步驟，精簡介紹如下：A.DNA富集：TE緩沖液中加入棉籽油，混勻后，13 000 r／min，室溫離心3 min，棄油脂；重復多次使 DNA富集于水相。水相400μL／管分裝于1.5 mL離心管。B.裂解：水相中加入SDS／CTAB提取液，65℃水浴30 min，每10 min輕微搖勻1次。C.純化，分離有機相：SDS提取液裂解后加入醋酸鈉溶液（NaAc），而用CTAB提取液裂解后加入等體積三氯甲烷：異戊醇（24：1）；輕微混勻后靜置，13 000 r／min，離心 5 min，轉移上清；反復抽提1次；D.沉淀DNA：上清中加入擔體及沉淀劑，輕微混勻后-20℃過夜；13 000 r／min，4℃，離心 10 min，棄上清；E.洗滌，干燥：用70%乙醇洗滌沉淀2次，干燥15 min；F.溶解 DNA：加入0.1×TE溶解 DNA，37℃保溫1 h后，4℃保存。

在基本流程的基礎上，5種DNA提取方案的優化流程不同，具體步驟如下：

1.3.1 SDS法

A.400μL TE緩沖液中加入1 mL棉籽油，上下顛倒混勻5 min，離心3 min；去上層油脂；重復20次，得約400μL水相；→B.水相中加入200μL 20%SDS，水??；→C.加入 100μL 5 mol／L NaAc，輕輕搖勻，冰上放置30 min，離心10 min；→D.將上清移至新離心管，加入1μg擔體、等體積無水乙醇和0.1倍體積3 mol／L NaAc（pH 5.2），顛倒混勻后，-20℃放置2 h；離心，棄上清；→E.沉淀用500μL 70%乙醇洗滌兩次，干燥15 min；→F.加入30μL 0.1×TE。

1.3.2 國標法

A.DNA富集同1.3.1；→B→C→D.沉淀DNA時加入1μg擔體，450μL異丙醇；→E.500μL 70%乙醇洗滌兩次；→F.加30μL 0.1×TE溶解DNA。

1.3.3 大量富集法

A.50 mL離心管中加入5 mL TE和35 mL棉籽油，富集15次并400μL／管分裝水相；→B→C.純化后所有上清移至一個10 mL離心管；→D.沉淀DNA時加入10μg擔體，0.6倍體積的異丙醇；→E.2 mL 70%乙醇洗滌2次；→F.用50μL 0.1×TE溶解DNA，37℃水浴1 h后移至1.5 mL離心管，4℃保存。

1.3.4 直接抽提法

A.50 mL離心管中加入5 mL含1%β-巰基乙醇的CTAB提取液（現用現配，65℃預熱）和35 mL棉籽油，180次／min，45℃，振蕩 30 min后，離心 5 min。去除油層，富集6次。水相按600μL／管加入1.5 mL離心管中；→C.每管加600μL三氯甲烷：異戊醇進行純化，純化后所有上清移至10 mL離心管；→后續步驟同1.3.3。

1.3.5 上清重復離心法

A.50 mL離心管中加入35 mL棉籽油和5 mL TE，平置于振蕩儀，固定，180次／min，37℃，振蕩 30 min，離心5 min，去油脂層；富集 10次并 400μL／管分裝水相；→B→C.純化同1.3.3；→D.沉淀DNA時加入10μg擔體，0.6倍體積的異丙醇，-20℃過夜后離心15 min；并將上清輕輕移至另一10 mL離心管重復離心一次，棄上清；→E.2管均用2 mL 70%乙醇洗滌兩次；→F.2管中各用30μL 0.1×TE溶解DNA，37℃水浴1 h后移至同一個1.5 mL離心管，4℃保存。

1.4 效果評估

由于各方案在沉淀DNA過程中都加入了擔體，無法檢測棉籽油DNA實際濃度和純度，因此用PCR擴增結果比較各方案的DNA提取效率。本試驗對小片段內源基因tRNALeu（180 bp）進行PCR擴增，以其產物的凝膠成像結果評估食用棉籽油DNA的提取效果，并對提取效率最高的方案中獲得的DNA進一步用外源基因FMV35S（210 bp）進行擴增，驗證DNA產物能否進行棉籽油轉基因成分檢測。

1.4.1 PCR引物序列

表2 PCR引物序列及產物大小

1.4.2 μL PCR反應體系

rTaq預混液12.5μL，10 mmol／L的上下游引物各1μL，DNA模板3μL，去離子水7.5μL?？瞻讓φ找詿o菌雙蒸水代替樣品提取DNA，陰性對照以擔體DNA為擴增模板，陽性對照以轉基因棉籽油為底物，在各方案中提取的DNA為擴增模板。

1.4.3 PCR擴增程序

tRNALeu擴增程序：變性階段：95℃，4 min。擴增階段：95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，60 s；循環 30次。延伸階段：72℃，5 min。4℃終止反應。

FMV35S擴增程序：變性階段：95℃，5 min。擴增階段：95℃，20 s；55℃，40 s；72℃，60 s；循環 40次。延伸階段：72℃，5 min。4℃終止反應。

1.4.4 電泳檢測

取10μL PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察電泳結果。

2 結果與分析

2.1 樣品tRNALeu基因PCR檢測結果

圖1為以5種方案提取的DNA為模板，進行內源基因tRNALeu擴增產物電泳圖。

圖1 5種方案提取的DNA產物進行tRNALeu擴增后的電泳結果

圖1結果顯示，SDS法擴增的目的條帶最少，國標法次之，直接抽提法、大量富集法、上清液重復離心法提取效率依次增高，分別得到4、5、6、10、12個目的條帶。其中2、6、10、11號樣品在5種方案中都擴增出目的條帶，2號和6號樣品DNA擴增條帶最亮，表明其DNA濃度高；1、9、13號樣品均未擴增成功；其他樣品DNA在部分方案中擴增出目的條帶。

從加工程度分析，2號和6號樣品為浸出三級棉籽油，10號和11號樣品為半精煉棉籽油，DNA在5種方案中全部提取成功；1、9、13為全精煉棉籽油，5種方案均未提取成功。表明棉籽油精煉程度越深，DNA降解越嚴重，含量可能越少。從樣品存放時間來看，3、9、13號樣品的存放時間均超過6個月，其他樣品的存放時間較短。食用油長期存放也可能加重DNA的降解程度。

DNA富集步驟中，方案SDS法和國標法的底物少，DNA提取效率低，后3種方案將樣品大量富集后，DNA提取效率增高。其中大量富集法是國標法的直接改進，加大樣品富集量后，提取DNA效率比國標法增高了1倍。從操作步驟進行分析，SDS法產物低也可能是沉淀過程中的pH不當，影響了DNA的完全沉淀，造成DNA流失。直接裂解法用CTAB進行富集和裂解處理，步驟簡單，但結果提取效率偏低，可能由于富集過程油相和水相的交界面出現較多的膏狀物質，形成了固體斜面，將其去除后水相產物減少；另外，該方案在CTAB提取液中加入1%β-巰基乙醇用于消泡、抗氧化及去除酚類，提取效率卻沒有提高，推測酚類物質可能極少，不會干擾DNA的提取效率。上清重復離心法是本試驗的最優提取方案，在樣品大量富集的基礎上將離心管平置振蕩，加大了DNA在水相的溶解程度；適當延長了離心沉淀的時間，并將異丙醇沉淀后的上清液重復離心，DNA提取效率最高。

2.2 外源基因檢測結果

圖2為以方案5提取到的12個DNA產物為模板，進行FMV35S外源基因擴增的凝膠電泳圖，含轉基因成分的 3、4、8、12、14、15號樣品全部被檢測出。

檢測結果與產品標簽一致，表明上清重復離心法得到的DNA提取液可用于轉基因成分的定性檢測。圖中8號樣品的轉基因目的條帶較模糊，是由于其DNA提取液的濃度偏低，這與圖1 e中8號樣品的擴增電泳條帶較暗相一致。

3 討論

作物的種子和其他組織含有豐富的DNA，但食用油經過多重加工后DNA含量極少，提取DNA的難度加大［15-18］。5種方案提取精煉棉籽油DNA的結果說明，棉籽油經過理化處理、加熱等步驟后，精煉程度越深，油中的DNA含量越少，提取難度越大。此外，存放時間越長，DNA降解可能越嚴重。

PCR擴增進行效果評估時，目標片段的選擇會影響檢測結果［6］。植物油加工過程中會不同程度的斷裂基因組DNA，本研究選用多拷貝小片段基因為引物，即180 bp的tRNALeu內源基因和210 bp的FMV35S外源基因，有效降低了擴增的假陰性率。引物的特異性強，可用于常規的核酸檢測。

4 結論

本試驗采用5種DNA提取方案，通過比較內源基因tRNALeu的擴增結果，確定上清重復離心法在本試驗中的DNA提取效率最高。其獲取的DNA提取液能進一步擴增外源基因FMV35S，用于棉籽油轉基因成分的定性檢驗。該方法的優點總結如下：

4.1 先將油DNA溶于TE緩沖液，再用CTAB提取DNA的效率高；加大DNA與TE緩沖液的溶解程度有利于提高DNA的提取效率。

4.2 DNA大量富集是成功提取精煉棉籽油DNA的關鍵。

4.3 三氯甲烷：異戊醇（24∶1）反復抽提1次，可較大程度提高DNA純度。

4.4 加入異丙醇后于-20℃沉淀過夜，使DNA沉淀徹底；將異丙醇沉淀后的上清液重復離心，收集沉淀，能有效減少人為操作引起的DNA損失，這對于提高DNA的提取效率至關重要。

［1］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.SN／T 1203—2003食用植物油脂中轉基因植物成分定性PCR檢測方法［S］.廣州：中國標準出版社

［2］中華人民共和國出入境檢驗檢疫局.SN／T1199—2003棉花種轉基因成分定性PCR檢測方法［S］.北京：中國標準出版業，2003

［3］Gryson N，Ronsse F，Messens K，et al.Detection of DNA during the refining of soybean oil［J］.Jouenal of American Oil Chemists’Society，2002，79（2）：171-174

［4］鄧鴻鈴，覃芳芳，郭新東，等.食用大豆油中轉基因成分的檢測［J］.中國油脂，2007，32（8）：79-81

［5］程紅梅，彭于發，金蕪軍，等.一種快速、簡便提取大豆油DNA的方法及轉基因大豆油的檢測［J］.中國農業科學，2007，40（5）：1069-1072

［6］袁建琴，唐中偉，許冬梅，等.轉基因棉子油的快速PCR檢測研究［J］.棉花學報，2009，21（2）：153-155

［7］楊冬燕，鄧漢超，楊永存，等.精煉食用植物油PCR檢測技術研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2010，（4），700-702

［8］楊冬燕，楊永存，張海龍，等.核酸富集處理對精煉食用植物油DNA提取效率的影響［J］.中國衛生檢驗雜志，2009，（12）：2770-2772

［9］Testolin R，Lain O.DNA Extraction from Olive Oil and PCR Amplification of Microsatellite Markers［J］.Journal of food science，2005，70（1）：C108-C112

［10］Catherine B，Delphine C，Isabelle M，et al.Comparative study of methods for DNA preparation from olive oil samples to identify cultivar SSR alleles in commercial oil samples：possible forensic applications［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2004，52（3）：531-537

［11］Wu Yajun，Chen Ying，Ge Yiqiang，et al.Detection of olive oil using the Evagreen real-time PCR method［J］.European Food Research and Technology，2008，227（4）：1117-1124

［12］何景，許文濤，黃昆侖.食用油DNA提取及檢測技術的研究進展［J］.食品工業科技，2012，33（12）：382-386，391

［13］張秀豐，孫旭東，張偉，等.五重 PCR檢測轉基因大豆［J］.中國糧油學報，2008，23（3）：194-198

［14］Silvia D，Lee D.Development of sensitive crop-specific polymerase chain reaction assays using 5S DNA：Applications in food traceability［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（12）：4640-4644

［15］梅玲玲，徐藝珍，程蘇云，等.轉基因食品DNA提取技術研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2005，15（6）：689-690，749

［16］Shahzadi I，Ahmed R，Hassan A，et al.Optimization of DNA extraction from seeds and fresh leaf tissues of wild marigold（Tagetesminuta）for polymerase chain reaction analysis［J］.Genetics and Molecular Research，2010，9（1）：386-393

［17］嚴明理，劉忠松，官春云，等.用于PCR分析的芥菜型油菜總DNA的快速提?。跩］.現代農業科技，2008（16）：172-173

［18］覃文，董潔，鄧鴻鈴，等.PCR法定性檢測食用油脂中轉基因成分［J］.中國油脂，2002，27（3）：4-6.

A Comparative Study of Different Methods of DNA Extraction of Cottonseed Oil

Fu Xiaohua1Zhang Yan2Zhang Wei2Wang Hong1，2Wu Tao2Zhou Wei2，3
（College of Life Sciences，Hebei Normal University1，Shijiazhuang 050024）
（Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research2，Shijiazhuang 050071）
（College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei3，Baoding 071000）

The research has designed five different schemes to extract DNA of 15 cottonseed oil samples with different machining accuracy from different manufacturers，which based on the SDSmethod as well as national standard method for DNA extraction of edible oil.The research estimated the DNA extraction efficiency by comparing PCR amplification results of the endogenous gene tRNALeu of DNA extract from different sources.Amplified the exogenous gene FMV35S from the obtained DNA of the fifth scheme to detect genetically modified ingredients.The results showed that the fifth method made the higher DNA-extracting efficiency than the other methods；the DNA extracted by the fifth method can also be adopted for the qualitative detection of genetically modified ingredients in cottonseed oil.

cottonseed oil，DNA extraction，enrichment treatment，genetically modified organisms（GMO）

TS221

A

1003-0174（2014）03-0042-05

河北省質量技術監督局科研項目（2011ZD06）

2013-04-25

付曉華，女，1984年出生，碩士，應用微生物

周巍，男，1983年出生，工程師，農產品加工與儲藏工程