素馨花提取物橄欖苦苷在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

郝 婷，尹營(yíng)松，李亞洲，劉麗艷，陳四平，趙桂琴

1承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德 067000;2 河北師范大學(xué)藥物研究所，石家莊 050011

橄欖苦苷是一種裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物，作者從素馨花(Jasminum officinale L.var.grandiflorum)70%乙醇提取物中分離得到。該物質(zhì)體內(nèi)外抗乙型肝炎病毒(HBV)活性明確，在素馨花藥材中含量豐富(初步估算超過(guò)5%)［1］，易于分離純化，有望成為新型抗HBV 活性先導(dǎo)化合物。本文建立了測(cè)定橄欖苦苷含量的HPLC 方法，并應(yīng)用該方法對(duì)橄欖苦苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑

甲醇(色譜純，Dikmapure);甲醇(分析純，天津賽孚試劑廠);甲酸(分析純，天津市佳興化工廠);市售純凈水;橄欖苦苷(實(shí)驗(yàn)室自制，純度大于98%);內(nèi)標(biāo)物黃芩苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110715-201016)。

1.2 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀(HPLC);HC-2062 高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);梅特勒-托利多AG245 型分析天平(瑞士);KQ-100E 超聲清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠120 只，體重180～200 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證:0237506。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:水-甲醇-甲酸(63∶37∶1);檢測(cè)波長(zhǎng):276 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 給藥及樣品采集

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定大鼠灌胃低、中和高劑量分別為100、200 和400 mg/kg。取Wistar 大鼠120只，隨機(jī)分成低、中、高劑量組，每組40 只給藥前12h 禁食，自由飲水。將橄欖苦苷配制為相應(yīng)濃度的溶液，i.g.給藥，給藥容積為10 mL/kg，給藥后自由飲水，分別于i.g.后5、10、15、30、60、120、240、480 min 采用400 μL 一次性負(fù)壓采血管(肝素鈉抗凝)，腹主動(dòng)脈取血400 μL(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5 只)，于2500 rpm 離心15 min，分離血漿，-20 ℃保存。

2.3 血漿樣品預(yù)處理［2-5］

精密吸取空白血漿100 μL，依次加入1 mol/L磷酸二氫鉀溶液50 μL 及5 μL 內(nèi)標(biāo)物，渦旋20 s，依次加入甲醇100 μL，乙腈350 μL，渦旋5 min，超聲20 min，3000 rpm 離心，取上清液，40 ℃氮?dú)鈸]干，殘?jiān)?00 μL 流動(dòng)相復(fù)溶，14000 rpm 離心，取上清液，進(jìn)樣20 μL，HPLC 法測(cè)定。

2.4 血漿樣品中橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取空白血漿100 μL，加入不同濃度橄欖苦苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液25 μL 和0.12 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液5 μL，配置成橄欖苦苷血漿標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度分別為5.25、10.5、16.75、21、26.25、52.5 μg/mL，每一濃度平行配置3 份，按“血漿樣品處理”項(xiàng)操作后，取上清液，進(jìn)樣20 μL，每個(gè)樣品進(jìn)樣3 次，HPLC 測(cè)定，記錄峰面積，取平均值。

2.5 精密度與準(zhǔn)確度

制備橄欖苦苷低、中、高3 個(gè)濃度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)為質(zhì)量控制(QC)樣品，每個(gè)濃度平行處理5 份，按照“血漿樣品處理”項(xiàng)操作，每個(gè)樣品測(cè)定一次，于一個(gè)工作日內(nèi)完成，計(jì)算日內(nèi)精密度。同樣的QC 樣品連續(xù)重復(fù)3 d，計(jì)算日間精密度。

2.6 方法回收率的測(cè)定

制備橄欖苦苷低、中、高3 個(gè)濃度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)為質(zhì)量控制(QC)樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)操作，以提取后的色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)溶的峰面積比值帶入回歸方程，所得濃度與實(shí)際濃度的比值即為方法回收率。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

考察橄欖苦苷低、中、高3 個(gè)濃度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)QC 樣品的穩(wěn)定性，以橄欖苦苷的峰面積為指標(biāo)，血漿樣品處理后，4 ℃放置3 d，HPLC檢測(cè)，記錄峰面積。

2.8 數(shù)據(jù)分析

灌胃給藥后橄欖苦苷的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用3P97 藥代動(dòng)力學(xué)軟件分析。組間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 血漿樣品中橄欖苦苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以血漿樣品中橄欖苦苷濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，求得橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0442x-0.038(R2=0.9991)，線性范圍5.25～52.5 μg/mL，信噪比S/N=3 時(shí)定量限為5.25 μg/mL。

3.2 精密度與準(zhǔn)確度

血漿中低、中、高濃度的橄欖苦苷的日內(nèi)、日間精密度RSD 值均小于±5%，準(zhǔn)確度RE 值均小于±10%，其中，血漿中低、中、高濃度的橄欖苦苷的日內(nèi)峰面積RSD 分別為1.96%、2.34%、1.87%;血漿中低、中、高濃度的橄欖苦苷日間峰面積RSD 分別為2.89%、3.67%、2.96%。

3.3 方法回收率的測(cè)定

血漿中低、中、高濃度的橄欖苦苷的提取回收率分別為96.9%、98.2%、102.7%。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

血漿中橄欖苦苷低、中、高3 個(gè)濃度(5.25、16.75、26.25 μg/mL)QC 樣品的穩(wěn)定性，以橄欖苦苷的峰面積為指標(biāo)，血漿樣品處理后，4 ℃放置3 d，橄欖苦苷的RSD 分別為7.1%、8.4%、3.92%。

3.5 藥時(shí)曲線及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

大鼠灌胃給予低、中、高3 個(gè)劑量橄欖苦苷后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(圖2)，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用3P97 藥代動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行處理，所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1，經(jīng)3P97 軟件擬合，體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合二室模型，結(jié)果顯示半衰期t1/2分別為15.189、32.829、55.097 min，清除率CL/F 分別為0.0174、0.0526、0.0653 μg/(μL·min)，隨劑量的增大而延長(zhǎng)，藥物濃度-時(shí)間曲線下面積AUC 分別為5759.51、3804.57、6250.72 μg/(min·μL)，隨劑量的增大先減小后增大，顯示出非線性藥代動(dòng)力學(xué)特征

表1 大鼠灌胃不同劑量橄欖苦苷藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=5，)Table 1 Main pharmacokinetic parameters of oleuropein after i.g.administration of different dose of oleuropein extract to rats (n=5，)

注:與中、高劑量組比較，* P ＜0.05。Note:Compare with middle，high dose group，* P ＜0.05.

圖1 大鼠灌胃不同劑量橄欖苦苷體內(nèi)的平均藥時(shí)曲線Fig.1 Mean plasma concentration-time curve of oleuropein after i.g.administration

4 討論

由于大鼠個(gè)體間存在差異可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差，本實(shí)驗(yàn)中的大鼠均采用完全隨機(jī)法進(jìn)行分組。取各組大鼠血藥濃度的平均值，用3P97 藥動(dòng)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，求出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，盡可能減少由于大鼠個(gè)體差異所造成的數(shù)據(jù)偏差。

研究結(jié)果表明，大鼠灌胃不同劑量橄欖苦苷時(shí)，橄欖苦苷的t1/2隨給藥劑量增大而顯著延長(zhǎng)，AUC先減小后增大，推測(cè)橄欖苦苷在大鼠體內(nèi)為非線性動(dòng)力學(xué)過(guò)程［6］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中、高劑量組(200 mg/kg 和400 mg/kg)大鼠血漿的藥時(shí)曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，而低劑量組(100 mg/kg)未出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。藥物的吸收出現(xiàn)多峰現(xiàn)象存在多種原因，如肝腸循環(huán)、多部位吸收、體內(nèi)再分布等。中、高劑量組的雙峰現(xiàn)象可能是因?yàn)殚蠙炜嘬赵诖笫篌w內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)存在肝腸循環(huán)，或快速分布至其它臟器后再次吸收入血。相關(guān)研究有待深入進(jìn)行。

本實(shí)驗(yàn)也做了方法專屬性考察，結(jié)果表明血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾橄欖苦苷的含量測(cè)定，內(nèi)標(biāo)物與橄欖苦苷分離完全，峰形良好，該方法適用于本實(shí)驗(yàn)。

本研究均按照2010 版藥典的附錄XIX B，即生物樣品分析方法的基本要求，進(jìn)行操作［7］，符合國(guó)內(nèi)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

1 Zhao GQ(趙桂琴).Studies on the chemical constituents and anti-HBV activity of Jasminum officinale L.var.grandiflorum.Beijing:Academy of Military Medical Sciences (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，PhD.2008.

2 Zhao XY(趙緒元)，Yao JC(姚金成)，Hu L(胡領(lǐng))，et al.Determination of Baicalin of Yinhuan granules in rat plasma by HPLC and study on its pharmacokinetics.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2007，19:645-647.

3 Zhang Y(張楊)，Zhang ZQ(張振秋)，Sun ZS(孫兆姝)，et al.Pharmacokinetic of berberine in combination of Cortex Phellodendri and Rhizoma atractrylodis in rat.Chin Tradit Pat Med(中成藥)，2009，31:1351-1354.

4 Tian JZ(田景振)，Wei FH(魏鳳環(huán)).Study on pharmacokinetics of puerarin sustained-release capsules in rabbits after intravenous administration.J Shandong Univ Tradit Chin Med (山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào))，2003，27:4542-4561.

5 Deng XG(鄧新國(guó))，Hu SX(胡世興)，Zhang QJ(張清炯)，et al.Pharmacokinetic study of puerarin in aqueous humor of rabbits following intraperitoneal injection.Chin Ophth Res(眼科研究)，2003，21:2582-2601.

6 Liu YM(劉亦明)，Lin AH(林愛(ài)華)，Chen H(陳匯)，et al.Study on pharmacokinetics of scutellarin in rabbits.Acta Pharm Sin(藥學(xué)學(xué)報(bào))，2003，38:775-778.

7 Chinese Pharmacopoeia Commission (國(guó)家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國(guó)藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Appendix XIX B.