牡丹皮化學成分系統化色譜分離方法研究

朱靖博 ，韓聰敏，丁 燕，寇自農，王振中，蕭 偉

1大連工業大學食品學院;2 大連工業大學分析測試中心，大連 116034;3江蘇康緣藥業股份有限公司，連云港 222001

中藥現代化的核心是對中藥成分的系統性認識，包括化學成分與藥理活性的認識，其中化學成分認識的前提是對化學成分的系統性分離。中藥成分具有種類繁多、共存多種結構類似物、化學穩定性差、理化性質跨度大等特點［1，2］。針對中藥特點制定系統分離方法是實現中藥現代化的關鍵，而色譜分離技術是實現中藥成分系統分離的有效手段;植物提取物的色譜條件篩選及快速分離制備已有相關報導［3，4］。至今已從牡丹皮中發現了80 多種化學成分，包括丹皮酚類、芍藥苷類、黃酮類、三萜類、甾體類等多種化合物［5］。鑒于中藥成分的復雜性和色譜分離技術的特殊性，提高色譜分離效率、降低色譜柱污染，研究系統化色譜分離方法分離牡丹皮中的化學成分，形成具有指導意義的體系與程序對于中藥現代化研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牡丹皮藥材由江蘇康緣藥業股份有限公司提供。分析級甲醇、正己烷、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、二氯甲烷、丙酮，天津大茂化學試劑廠;工業級甲醇、氯仿、丙酮，天津科密歐化學試劑有限公司;色譜級乙腈，美國Tedia 公司;超純水，實驗室自制。

高效液相色譜儀UltiMate3000，美國戴安公司;R502B 旋轉蒸發儀、SHZ-D (Ⅲ)循環水式真空泵，鞏義予華儀器責任有限公司;升降恒溫水浴鍋，英峪高科儀器廠;硅膠GF254板、薄層層析硅膠，青島海洋化工有限公司;制備柱4 cm ×40 cm，實驗室自制;P270 高壓恒流泵，大連依利特公司。

圖1 牡丹皮化學成分系統分離流程Fig.1 Systematic separation flow chart of chemical components from Moutan Cortex

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC 分析條件

HPLC 條件:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);進樣量20 μL，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫為室溫。流動相0.01% 甲酸-水(A)和乙腈(B)。線形梯度洗脫程序為:0～2 min，5% B;2～30 min，5%～16% B;30～70 min，16%～33% B;70～80 min，33%～80% B。

1.2.2 系統化色譜分離方法研究路線

總體思路:甲醇提取牡丹皮藥材得到提取物，對提取物進行系統溶劑萃取評價;經TLC 和HPLC 分析選出適宜的前處理萃取溶劑。再對每個部位進行色譜分離條件篩選。選定其中一個部位，研究色譜分離條件的篩選方法，利用薄層色譜中Rf值與柱色譜洗脫速度之間的關系，進行多階梯梯度分離預測;同時進行制備柱色譜分離驗證預測結果。本文以牡丹皮正己烷相經真空液相層析后得到的Fr1.3 組分為例，論證色譜分離洗脫體系及洗脫強度篩選，確定組分的色譜分離條件的過程。總體路線如圖1 所示。

1.2.3 藥材提取

牡丹皮藥材8.90 kg，粉碎過篩后甲醇加熱回流提取(料液比1∶6)3 次，每次2 h，合并濃縮得到甲醇提取物。

1.2.4 系統溶劑萃取評價

分別稱取4.0 g 牡丹皮甲醇提取物三份，加水至320 mL，用50%碳酸氫鈉溶液調節pH 分別至4、7、9。按照圖2 實驗設計進行萃取評價，TLC、HPLC分析所得樣品成分變化，確定色譜前處理的萃取溶劑。TLC 分析條件:有機相為V正己烷:V丙酮=7∶3，水相為V氯仿:V甲醇=8∶2，顯色劑為5%香草醛濃硫酸。

圖2 牡丹皮甲醇提取物系統溶劑萃取評價Fig.2 Evaluation of systematic solvent extraction of Moutan Cortex methanol extract

圖3 正相色譜分離條件系統篩選Fig.3 Systemic screening of separation condition in normal phase chromatography

表1 TLC 展開溶劑系統篩選實驗條件Table 1 Systemic screening of TLC solvent system

1.2.5 色譜分離條件研究

1.2.5.1 待分離組分準備

牡丹皮甲醇提取物經正己烷、乙酸乙酯依次萃取，得到正己烷相、乙酸乙酯相和水相三個組分。正己烷相樣品(240 g)經硅膠真空液相柱層析V正己烷∶∶V丙酮=100∶0、90∶1、70∶1、50∶1、20∶1、1∶1 洗脫，合并各洗脫液，共得Fr1.1～Fr1.5 五個組分。

1.2.5.2 牡丹皮各部位色譜分離填料及流動相篩選

牡丹皮正己烷、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、水相部位、正己烷相部位的Fr 1.3 分別用硅膠板、聚酰胺板和中性Al2O3板進行薄層色譜分析，以斑點個數(N)、難分離物質對ΔRf為指標，考察三種填料的分離情況。實驗設計見圖3。

1.2.5.3 流動相洗脫比例篩選

在選定洗脫溶劑的基礎上進行二元溶劑100∶0、99∶1、98∶2、97∶3 等的依次展開，同時對洗脫初始條件進行連續四次展開，Rf考察范圍為0.10～0.70。

1.2.6 多階梯梯度分離預測

圖4 一階梯度(A)、二階梯度(B)洗脫色譜柱內溶質X、Y 預測分離圖Fig.4 Predicted column chromatography charts of first step gradient (A)and second step gradient (B)of compound X and Y

依據色譜理論［6］，容量因子k 與TLC 中比移值Rf滿足關系式k=1/Rf-1(1)，多階梯梯度洗脫色譜中［7］，溶質在色譜柱內的移動速率滿足Ux=U0/(1+k)(2)(其中U0、Ux為色譜柱內流動相流速、化合物X移動速度，圖4)，由(1)、(2)可得Ux=U0·Rf(3)，則第一個臺階洗脫下化合物X 的保留時間tRx=L/Ux=L/(U0·Rfx)=t0/Rfx，保留體積VRx=tRx·U0;第二個臺階梯度時:在前一個臺階洗脫基礎上，未洗脫化合物Y 的保留時間tRy=(L-tRx·Uy1)/Uy2;VR2=tRy·U0。Uy1、Uy2分別是Y 在色譜柱內第一、第二階梯洗脫下的移動速度。選擇正己烷相Fr

1.3 進行臺階梯度洗脫分離下保留值預測。

1.2.7 制備柱色譜分離

制備柱為4 ×40 cm，薄層硅膠干法裝柱，初始溶劑90 mL/min 沖洗至柱壓恒定，空柱體積V0=490 mL，洗脫流速25 mL/min，柱壓2.2～2.4 MPa，柱硅膠235～240 g。上樣量分別為0.55 g、1.55 g、3.95 g，參考上樣量公式［4］為SiO2g=151.2Sg+0.5，SiO2g=59.8Sg，洗脫餾分1/5 柱體積(約100 mL)。

2 結果與討論

2.1 藥材提取與分析

牡丹皮藥材8.90 kg 提取得到2.54 kg 浸膏，得率28.5%。液相色譜檢測結果(圖5)顯示牡丹皮甲醇提取物成分復雜，對化合物的分離制備需借助萃取等前處理技術及系統色譜條件篩選來完成復雜化學成分的系統性分離。

圖5 牡丹皮甲醇提取物HPLCFig.5 HPLC chromatogram of Moutan Cortex methanol extract

2.2 系統溶劑萃取評價

TLC 結果顯示:有機相與水相成分明顯不同，其中丹皮酚主要集中于正己烷相，且以酸性溶液中最顯著，pH 增大過程中，化合物的萃取效率增大(圖6，每個板點樣樣品依次為正己烷相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相、丹皮酚、牡丹皮甲醇提取物)，氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相成分區別不大;各水相成分則在pH 變大過程中斑點減少。說明堿性條件利于提高萃取效率。HPLC 結果(圖7)顯示pH 改變對于正己烷相、氯仿相的影響不大，而乙酸乙酯相和正丁醇相變化顯著，以正丁醇萃取有機相為例，色譜峰明顯減少，說明pH 增大牡丹皮化學成分改變，萃取適宜在原pH 下進行。牡丹皮甲醇提取物系統萃取最終選擇在pH=4 下采用正己烷、乙酸乙酯依次萃取。

圖6 萃取評價有機相、水相TLC 結果Fig.6 TLC results of organic phase and water phase of Moutan Cortex methanol extract

圖7 不同pH 溶液有機萃取相HPLC 譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of organic phase extract with different pH

2.3 柱色譜分離條件篩選

2.3.1 待分離組分分析

TLC 分析結果顯示正己烷相的Fr1.3 組分在香草醛濃硫酸顯色后有6 個斑點，HPLC 結果顯示主要有三個色譜峰，通過薄層制備對6 個化合物進行分離，得到6 個化合物的單點，用同樣的HPLC 條件進行分析對照，確定了TLC 與HPLC 的對應關系。如圖8 所示，TLC 中2、3、4 斑點分別對應HPLC 三個色譜峰。

圖8 Fr1.3 組分TLC、HPLC 分析Fig.8 TLC and HPLC analysis results of Fr1.3

2.3.2 分離流動相篩選

采用1.2.5.2 流動相篩選體系，以斑點個數、難分離物質的分離度以及斑點是否拖尾作為評價指標，篩選Fr1.3 分離體系。結果顯示S2 氯仿-丙酮體系，斑點數目最多，難分離物質對ΔRf為0.06，確定氯仿-丙酮體系為Fr1.3 組分的洗脫溶劑體系。

2.3.3 洗脫流動相比例篩選

分別以V氯仿:V丙酮=100∶0、99∶1、98∶2、97∶3、95∶5 為展開劑對Fr1.3 組分依次層析展開Rf的結果見表3，待分離化合物為1～6 的Rf在0.10 ＜Rf≤0.85，初始展開劑下的Rf在0.10 ＜Rf≤0.65，初始條件四次展開化合物1～6 的Rf變化在0.06 ＜Rf≤0.89(見表4)，難分離化合物對5、6 的ΔRf經后由0.06 增大為0.10，預示梯度洗脫分離6 個化合物是可能的。

表2 Fr1.3 組分分離系統TLC 溶劑篩選結果Table 2 Systemic screening results of TLC developing solvents for Fr 1.3

表3 Fr1.3 組分不同溶劑梯度連續展開TLC 的Rf值Table 3 Rf values of the six components in Fr1.3 under different developing solvents

表4 Fr1.3 組分初始洗脫條件下的四次展開結果Table 4 Rfvalues of the six components in Fr1.3 with four times development with initial solvent

2.4 臺階梯梯度預測結果

由臺階梯梯度公式計算Fr1.3 中目標化合物在兩臺階梯度洗脫分離時的保留體積VR，結果見表5。

表5 多階梯梯度保留體積預測結果Table 5 Prediction results of retention volume by multi-step gradients

2.5 制備柱色譜分離

選定臺階梯度洗脫條件下，1/3 理論上樣量0.55 g、理論上樣量1.65 g、最大上樣量3.95 g 的三次制備柱色譜分離實踐表明，Fr1.3 組分中的6 個化合物均得到TLC 單點的純化合物，其中2、3、4 等3 個化合物的HPLC 純度在95%以上。臺階梯度預測結果與實際保留體積一致(表6)，1、5、6 號化合物無紫外吸收。

圖9 從Fr1.3 分離出的化合物1～6 的TLC 圖Fig.9 TLC chromatograms of compounds 1-6 separated from Fr 1.3

表6 Fr1.3 組分三次制備柱分離結果Table 6 Results of three times medium-pressure liquid chromatography separation experiments

3 結論

本文以牡丹皮甲醇提取物為對象，研究建立了中藥復雜體系中化學成分系統色譜分離的前處理方法，構建了基于TLC、HPLC 分析的復雜體系制備色譜分離條件篩選體系，確定了牡丹皮正己烷相的色譜分離填料、洗脫溶劑體系和系統化色譜分離等條件;建立的系統化TLC 方法可以快速選定制備柱色譜的分離條件;臺階梯度洗脫分離情況下，分離目標化合物在初始洗脫溶劑下，其0.10 ＜Rf≤0.65 時，多階梯梯度預測方法準確預測了Fr1.3 組分制備柱分離各化合物的保留體積。該研究方法同樣適用于其他中藥組分的系統分離。

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