放線菌Snea253 代謝產物及寡糖對南方根結線蟲活性的影響

李玲玉，趙 迪，劉曉宇，陳井生，3，段玉璽，陳立杰*

1沈陽農業大學植物保護學院 北方線蟲研究所;2沈陽農業大學理學院，沈陽 110866;3 黑龍江農科院大慶分院，大慶 163316

根結線蟲(Meloidogyne spp.)廣泛分布于世界各地，寄主植物有3000 余種，黃瓜番茄等各類蔬菜、煙草、果樹和觀賞植物等都是其良好寄主［1］。根結線蟲病是世界農業生產上危害最嚴重的一類線蟲病害，對我國的蔬菜、經濟作物等種植已造成嚴重威脅。但是針對根結線蟲病的有效化學農藥如涕滅威、溴甲烷等陸續被禁用或限制使用，因此尋找替代的高效低度低殘留的有效藥劑成為當今世界研究熱點。目前生產中推廣使用的阿維菌素—鏈霉菌產生的抗生素是較為理想的防治藥劑，但是阿維菌素對根結線蟲卵無效。因此，尋找新的生物殺線劑，尤其是從放線菌的代謝產物中篩選高效低毒的生物殺線劑成為防治植物線蟲病的重要發展方向［2］。

放線菌中以鏈霉菌屬(Streptomyces)產生的生物活性物質最多。如阿維菌素是由灰色鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)發酵產生的大環內酯類抗生素［3］。目前已陸續發現幾種對線蟲有活性的放線菌代謝產物。放線菌Snea253 菌株(委內瑞拉鏈霉菌Streptomyces venezuelae)是本實驗室前期從土壤中分離得到的具毒殺植物線蟲活性的高效菌株，其代謝物對大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)、南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)和北方根結線蟲(M.hapla)的J2 均具有較高的生物活性，并且能夠抑制大豆胞囊線蟲卵的孵化［4，5］。經初步對其殺線蟲活性物質進行分離純化、結構解析，認為其可能含有氨基寡酸的糖類活性物質(待發表)，因此本文重點研究其代謝產物中殺線蟲活性物質及已知寡糖類物質對南方根結線蟲的活性。

寡糖素(Oligosaccharins)是Alberhseim 教授于1985 年首次提出的概念，活性寡糖具有調控植物生長、發育、繁殖、防病和抗病等多方面的功能［6］。各種活性寡糖可發出調節特定功能的信息，激活防御反應、誘導植物抗病性，調控植物生長，產生具有抗病害的活性物質，抑制病蟲害的形成和侵染，寡糖在農業生產上顯示出廣闊的應用前景［7］。鑒于本研究中Snea253 菌株發酵液中活性物質可能含有寡糖類物質，因此將此活性物質與已知寡糖共同測試對南方根結線蟲卵孵化和J2 活性的影響，以明確寡糖類物質對植物線蟲的毒力作用，為植物線蟲病害生物防治研究中生物殺線劑的研制提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

放線菌Snea253 菌株，菌株及其制備方法已獲得國家發明專利授權(ZL200810010465.X)。

1.2 放線菌Snea253 菌株發酵產物中活性物質的粗提取

用50 L～100 L 發酵罐GUGS-50 進行發酵，在28 ℃下培養，初始pH 為6，轉速150 r/min，發酵5～7 d。將放線菌Snea253 菌株發酵液濃縮10 倍，濃縮液和無水乙醇置于4 ℃冰箱中預冷12 h，再將兩者按1:5 混合充分搖勻靜置于4 ℃冰箱中12 h。取出混合液除去沉淀并用RE-52AA 旋轉蒸發儀將乙醇蒸掉，將所得的預處理液用CoolSafe55-4 冷凍干燥儀冷凍干燥成粉末。用HC-ADS-7 大孔吸附樹脂吸附樣品中的色素，去離子水洗脫，收集液體并冷凍干燥即得粗提物，備用。

1.3 放線菌Snea253 殺線蟲活性物質的成分分析

1.3.1 試管法分析活性物質［8］

取Snea253 粗提物樣品溶液1 mL 于試管中，加入顯色劑，不同化合物發生不同的顯色反應，從而鑒別其中化合物成分。用α-萘酚試劑和斐林試劑檢查糖及苷;茚三酮試劑和雙縮脲試劑檢查氨基酸、多肽和蛋白質;碘化鉍鉀試劑檢查生物堿;三氯化鐵試劑檢查酚類;鹽酸-鎂粉試劑和醋酸鉛試劑檢查黃酮及甙;Borntrager 試劑和醋酸鎂試劑檢查蒽醌及甙;堿性3，5-二硝基苯甲酸試劑和堿性苦味酸試劑檢查強心苷;異羥肟酸鐵試劑檢查內酯、香豆素及甙;氯化鈉-明膠試劑和新鮮石灰水試劑檢查鞣質;泡沫試劑和氯仿-濃硫酸試劑檢查皂甙;冰醋酸-硫酸試劑和氯仿-濃硫酸試劑檢查甾體萜類;揮發油試劑和油脂試劑檢查揮發油和油脂。

1.3.2 薄層層析法預試［8］

將Snea253 粗提物樣品點樣到硅膠薄層層析板上，用乙酸乙酯:甲醇:水:冰乙酸(V:V:V:V)=12:5:1:1 作展層劑，在層析缸內充分展開。硅膠板干燥后，噴顯色劑，各種化合物遇特異顯色劑顯示出特有的顏色，方法如上，從而判斷化合物的類型。

1.4 已知寡糖的選擇

所選用寡糖均為分析純，分別為D(+)半乳糖、D-果糖、D(+)木糖、L-山梨糖、D(+)麥芽糖、D(+)葡萄糖、乳糖和蔗糖。所用寡糖溶液的濃度與Snea253 活性物質的濃度相同，均為5 mg/mL。

1.5 南方根結線蟲卵囊和二齡幼蟲的獲得

在溫室中用盆栽番茄繁殖南方根結線蟲(番茄品種為L402)。第一代卵囊成熟后，將番茄根系取出，用水輕輕沖洗，小心挑取卵囊。卵囊在0.5%次氯酸鈉中消毒3 min，無菌水反復沖洗3 次，將消毒的部分卵囊置于自制孵化池中備用。

另一部分卵囊放在自制的孵化池中，孵化池放在少量無菌水的滅菌培養皿里，25 ℃恒溫箱中培養，每隔24 h 收集一次新孵化的南方根結線蟲J2，置于滅菌的培養皿中制成J2 線蟲懸液備用。

1.6 活性物質及寡糖溶液對南方根結線蟲卵囊中卵孵化的影響

取新鮮飽滿大小均一的消毒卵囊，每2 個消毒卵囊放入一個消毒孵化池中，再將孵化池放入盛有測試溶液的滅菌培養皿中，測試溶液包括5 mg/mL的Snea253 發酵液粗提取后的活性物質和5 mg/mL各類寡糖溶液各1 mL，以無菌水處理作為對照，為盡可能的減少皿中液體的蒸發，培養皿用封口膜密封，每個處理重復3 次。將放有卵囊的培養皿置于25 ℃恒溫箱中，7 d 后計數線蟲孵化總數，計算孵化相對抑制率。

1.7 活性物質及寡糖溶液對南方根結線蟲J2 的影響

在經過高溫滅菌的貝氏小皿中放入活潑的南方根結線蟲J2，各加入1 mL 的活性物質和寡糖溶液，以無菌水作為空白對照，每個處理重復3 次。各處理的貝氏小皿放入25 ℃恒溫培養箱中，24 h 后計數線蟲的死亡率，計算線蟲校正死亡率，采用毛針碰觸和NaOCl 刺激法來判斷線蟲的死活。

2 結果與分析

2.1 放線菌Snea253 代謝產物中活性物質的成分分析結果

對放線菌Snea253 發酵液中活性物質的化學成分進行試管預試和薄層層析，結果見表1、表2。通過試管法(表1)可知:α-萘酚試驗呈紫紅色環，斐林試驗呈磚紅色沉淀，說明該物質中含有糖成分;茚三酮試驗呈藍色，雙縮脲試驗不變化，說明含有氨基酸，從而排除了生物堿、酚類和醌、酮等其他物質的可能性。

薄層層析法(表2)可知，苯胺-二苯胺顯色劑呈藍色斑點，苯胺-鄰苯二甲酸試劑呈棕色斑點，α-萘酚試劑呈藍色斑點，仍然說明該活性物質中含有糖成分。茚三酮顯色劑呈粉紅色斑點，說明活性物質中含有氨基酸。其他的生物堿、酚類、醌、酮和有機酸、油脂類均無變化。

因此，可以判斷放線菌Snea253 發酵液的代謝產物中殺線蟲活性物質含有糖和氨基酸。而后經過柱層析、液相色譜、質譜和核磁共振成像初步解析為寡糖類(待發表)。

微生物產生的抗生素等生物活性物質主要來自放線菌中的鏈霉菌屬。阿維菌素是目前使用高效、低劑量的殺線蟲劑，目前陸續有研究者從鏈霉菌中分離出對植物線蟲有作用的抗生素、酸、黃酮等物質，但還沒有發現從鏈霉菌中分離出對植物線蟲有活性的寡糖類物質。

表1 放線菌Snea253 代謝產物中活性物質化學成分試管法分析結果Table 1 Snea253 metabolites identified by test tube method

表2 放線菌Snea253 代謝產物中活性物質化學成分薄層層析法分析結果Table 2 Snea253 metabolites by identified thin layer chromatography

2.2 Snea253 代謝產物中活性物質與寡糖對南方根結線蟲卵囊中卵孵化和J2 的影響

試驗選擇已知寡糖類物質8 種，比較與Snea253代謝產物中氨基寡糖對南方根結線蟲的卵和J2 的毒性，研究結果顯示，Snea253 代謝產物中的活性物質對南方根結線蟲的毒性最高，而其他寡糖類物質對根結線蟲毒性很低，甚至可以促進線蟲的卵孵化和J2 存活。

圖1 Snea253 活性物質和寡糖對南方根結線蟲卵孵化的影響Fig.1 Effect of Snea253 active substance and oligosacharides on egg hatching of M.incognita.

圖2 Snea253 活性物質和寡糖對南方根結線蟲卵孵化的相對抑制率Fig.2 Relative suppression rate of egg hatching of M.incognita by Snea253 active substance and oligosacharides

D(+)半乳糖、D-果糖和D(+)木糖對南方根結線蟲卵孵化具有顯著的促進作用;其次是乳糖、D(+)葡萄糖和L-山梨糖有一定的促進作用，但與對照相比不顯著;蔗糖和麥芽糖略有抑制，但也不顯著;而Snea253 活性物質則能夠顯著抑制南方根結線蟲的卵孵化(圖1)。而且Snea253 對卵囊中卵孵化的相對抑制率最高，達到84.95%;麥芽糖和蔗糖相對抑制率不顯著，但是半乳糖、果糖和木糖正相反，顯著促進了南方根結線蟲的卵孵化，乳糖、山梨糖和葡萄糖也有一定促進作用，但與對照相比不顯著(圖2)。

對南方根結線蟲J2 的致死率試驗中，Snea253活性物質對J2 的校正死亡率最高為98.21%，與寡糖和對照處理差異極其顯著，寡糖中除D(+)半乳糖的致死率為4.176%相比對較顯著外，其他寡糖對J2 致死效果均不顯著，而且葡萄糖、乳糖和蔗糖溶液中的線蟲沒有死亡現象，與無菌水對照相比，反而有促進J2 更活躍生存的作用(圖3)。

圖3 Snea253 活性物質和寡糖對南方根結線蟲J2 的致死率Fig.3 Mortality of M.incognita J2 by Snea253 active substance and oligosacharide

3 討論

農業生產中所用的寡糖是一類對生物具有某種或某類特定功效作用的低聚糖類，即為功能性寡糖，如殼寡糖、甘露寡糖、胡蘿卜寡糖等種類［9］。根據活性物質和已知寡糖對南方根結線蟲的作用，可推斷活性物質并不是簡單的寡糖而是功能性寡糖。Hirano 等研究顯示功能性寡糖可以作為抗菌劑直接殺死病原微生物［10］，Ayers 等發現寡糖也可以激發植物自身防衛反應以達到防治植物病害目的［11］。殼寡糖對小麥紋枯病、黃瓜灰霉病、辣椒白粉病等真菌病害和某些病毒病害及細菌病害都有明顯的防治效果［7］。也有研究發現殼聚糖處理可以誘導黃瓜對根結線蟲的抗病性［12］，因此，功能性寡糖對線蟲病害的防治研究將具有深遠意義。

關于微生物代謝產物中含氨基寡糖類物質對植物線蟲的活性研究報道很少。本研究證明委內瑞拉鏈霉菌Snea253 產生的含氨基酸的寡糖類物質對植物線蟲有活性。委內瑞拉鏈霉菌是研發較早的醫用抗生素來源菌之一。Uchida 從委內瑞拉鏈霉菌Tü 1102 中分離出核酸霉素(Rinamycin)，它能抑制真菌、酵母菌、革蘭氏陽性和一些陰性細菌［13］。委內瑞拉鏈霉菌還能產生大環內酯類抗生素如酒霉素(Methymycin)、新酒霉素(Neomethymycin)和苦霉素(Picromycin)［14］。但未見其抗生素對植物線蟲有活性的報道，因此需進一步進行系統的研究，以明確其殺線蟲活性物質的結構與功能，為植物線蟲病害的防治提供新的生防資源。

4 結論

本文經過薄層層析法和試管法測試了放線菌Snea253 發酵液中活性物質，顯色反應包含有氨基酸和糖類物質。根據之后對活性物質的分離純化及核磁、質譜結果，可以初步判定為寡糖類物質(待發表)。利用活性跟蹤測試，Snea253 活性物質對南方根結線蟲卵囊中卵孵化具有很強的抑制作用，對J2也有強烈的毒殺作用，24 h 校正死亡率即可達到98.21%，顯著高于各寡糖處理和空白對照。不同寡糖對南方根結線蟲的作用不同，相比Snea253 代謝產物的高活性而言，已知寡糖的作用非常微弱，有的甚至起到促進南方根結線蟲卵孵化和J2 存活的作用。如半乳糖、果糖和木糖顯著促進了南方根結線蟲的卵孵化，而葡萄糖、乳糖和蔗糖還有促進J2 存活的作用，推測可能這些已知寡糖為線蟲卵孵化和J2 存活提供了營養物質。

致謝:感謝沈陽農業大學植物保護學院于志國教授對本論文提供的建設性意見。

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