1-辛基-3-甲基咪唑二氰銨鹽/硫酸銨雙水相體系分離純化銀杏黃酮

許雪磊，李芬芳，譚志堅

中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長沙 410083

雙水相體系最先由瑞典倫德大學(xué)Albertsson 于1956 年提出，并應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的分離純化，經(jīng)過半個多世紀(jì)的發(fā)展，雙水相體系在生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化工等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［1，2］。雙水相體系實質(zhì)是把兩種聚合物或者一種聚合物與無機鹽以適當(dāng)?shù)臐舛热芙庠谒行纬苫ゲ幌嗳艿膬上唷Ｈ欢摷夹g(shù)在分離過程中存在一些問題，如易乳化，粘度大，分相時間長，成相聚合物成本高，聚合物回收難等［3］。

離子液體，是指在室溫或者接近室溫時由離子構(gòu)成呈液態(tài)的物質(zhì)，一般由有機陽離子和無機陰離子構(gòu)成。作為一種新型的綠色溶劑，離子液體具有其它溶劑無法比擬的優(yōu)點，如蒸汽壓低、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性高、熔程寬、溶解能力強、具有可設(shè)計性等［3-5］。

離子液體雙水相體系最先由Rogers［5］提出并應(yīng)用于分離過程;He［6］用親水性離子液體［C4mim］Cl-K2HPO4雙水相體系從人尿中萃取分離睪酮、表睪酮;Li［7］等也用［C4mim］Cl-K3PO4從罌粟殼中提取鴉片生物堿;Tan［8］等用［C4mim］［BF4］-NaH2PO4分離純化蘆薈多糖。本文通過建立親水性離子液體1-辛基-3-甲基咪唑二氰銨鹽［C8mim］［N(CN)2］與(NH4)2SO4雙水相體系，研究分離純化銀杏黃酮的最佳條件，實驗結(jié)果令人滿意。

1 材料與儀器

1.1 主要試劑和材料

離子液體 1-辛基-3-甲基咪唑二氰銨鹽(［C8mim］［N(CN)2］)，純度＞99%(中凱化工有限公司);蘆丁(阿拉丁試劑);市售銀杏葉(產(chǎn)自長沙);所需試劑均為分析純，實驗用水為二次去離子水。

1.2 儀器

電子天平FA2004(上海舜宇恒平科技儀器有限公司);紫外可見分光光度計755s(上海棱光技術(shù)有限公司);pH 計PHS-3C 型(上海精密科學(xué)儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋GL-HH-S11-8 型(上海圣科儀器設(shè)備有限公司);旋轉(zhuǎn)粘度計NDJ-79 型(上海森地科學(xué)儀器設(shè)備有限公司)

2 實驗方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取蘆丁10 mg 用60%的乙醇溶于100 mL 容量瓶中即(0.100 mg/mL)，精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2.5、5.0、7.5、10.0 及12.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中各加入30%乙醇使成12.5 mL，各精密加入5%的NaNO20.75 mL，搖勻后放置6 min，再各加入10%Al(NO3)30.75 mL。搖勻放置6 min 后，再加入1 mg/mL NaOH 5 mL，搖勻，用30%乙醇定容，混勻后放置15 min，得系列濃度為:0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。以第一瓶作空白，在510 nm 波長下進(jìn)行比色測定。用最小二乘法作線性回歸，回歸曲線:Y=10.24785X +0.00892，R=0.9995。

2.2 雙水相體系萃取銀杏總黃酮及其測定

向10 mL 的離心管中加入2.0 mL 二次蒸餾水，1 g 離子液體，0.5 mL 黃酮溶液，一定質(zhì)量的鹽。為了消除離子液體、鹽的干擾，參比溶液加入相同的相成分除了黃酮溶液。混合物充分?jǐn)嚢枰灾劣邴}完全溶解，很快溶液形成兩相，上相富含離子液體及黃酮，雜質(zhì)留在鹽相中，記錄上、下相的體積。用注射器將離子液體移至另一個10 mL 的離心管中，按上述方法測溶液的吸光度，從而計算出濃度。

Vt、Vb分別是上、下相的體積;

Ct、Cb分別是黃酮在上、下相的濃度;

V

t

、C

t

分別是上相的體積及黃酮濃度，m

s

總黃酮的質(zhì)量。

3 結(jié)果與討論

3.1 離子液體用量對萃取效率的影響

向體系中加入2.0 mL 二次蒸餾水，1.4 g(NH4)2SO4，0.5 mL 銀杏黃酮溶液，改變離子液體的用量在0.6～1.4 g(13.33%～26.41%)之間。結(jié)果如圖1 所示，隨著離子液體含量的增加，萃取效率增大，當(dāng)向體系中加入1.0 g 離子液體時，萃取效率達(dá)90.59%;繼續(xù)增大離子液體的量時，萃取效率增加的不明顯，考慮到節(jié)約離子液體用量，實驗中離子液體的加入量為1.0 g。

圖1 離子液體加入量的影響Fig.1 Effect of the amount of ionic liquid on extraction efficiency of G.biloba flavonoids

3.2 (NH4)2SO4濃度對萃取效率的影響

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的(NH4)2SO4對銀杏黃酮萃取效率(E%)、分配系數(shù)(Kd)、相比(R)的影響Fig.2 Effect of different mass fractions of (NH4)2SO4on extraction efficiency (E%)，partition coefficient(Kd)and phase ratio (R)of G.biloba flavonoids

向體系中加入2.0 mL 二次蒸餾水，1 g 離子液體，0.5 mL 銀杏黃酮溶液，改變鹽的用量，結(jié)果如圖2 所示，在鹽含量1.0～1.8 g(20.00%～31.03%)之間，隨著鹽含量的增加，萃取效率增大，是因為隨著鹽含量的增加，鹽析能力增強。然而繼續(xù)增加鹽含量時萃取效率反而減小，可能由于鹽濃度過大產(chǎn)生鹽析效應(yīng)的結(jié)果。分配系數(shù)的大小是由于體系中IL/黃酮、鹽/黃酮、水/黃酮分子之間的相互競爭的結(jié)果。實驗中鹽的加入量為1.4 g，即18.52%［C8mim］［N(CN)2］和15.93% (NH4)2SO4。

3.3 溫度對萃取效率的影響

按照實驗方法，固定其他條件。結(jié)果如圖3 所示，隨著溫度的升高，萃取效率降低，相體積比減小，是因為隨著溫度的升高，水從離子液體相轉(zhuǎn)移到鹽相，導(dǎo)致上相體積減小，下相體積增大，所以上下相體積比減小;下相體積增大，鹽濃度減小，鹽析能力降低，溫度升高離子液體在水中的溶解度增大，疏水性降低，所以萃取效率降低。

圖3 不同溫度對銀杏黃酮萃取效率(E%)、相比(R)的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction efficiency (E%)and phase ratio (R)

3.4 溶液酸度對萃取效率的影響

在其它條件固定不變的情況下，體系中加入不同pH 值的B-R 緩沖溶液。結(jié)果表明酸度對萃取效率影響不大，實驗結(jié)果如圖4 所示。銀杏黃酮溶液顯弱酸性，酸性條件下更有利于萃取的發(fā)生。實驗測得鹽相的pH 值為4.77，因此，體系中的pH 值不需要調(diào)節(jié)。

圖4 對銀杏黃酮萃取效率(E%)、分配系數(shù)(Kd)的影響Fig.4 Effect of pH value on extraction efficiency (E%)and partition coefficient (Kd)

3.5 離子強度對銀杏黃酮萃取效率的影響

如圖所示，隨著NaCl 量的增加，萃取效率和分配系數(shù)是先增大后減小，NaCl 量為1.5 mmol 時均達(dá)到最大。這是因為NaCl 在兩相中具有不同的分配系數(shù)，隨著NaCl 質(zhì)量的增加，兩相間電位發(fā)生變化，從而使銀杏黃酮的分配系數(shù)增大;但是增加到一定程度時，萃取極性增強，銀杏黃酮的溶解度減小，所以萃取效率和分配系數(shù)減小。因此，最佳NaCl 的量為1.5 mmol。

圖5 不同離子強度對銀杏黃酮的萃取效率(E%)、分配系數(shù)(Kd)的影響Fig.5 Effect of NaCl on extraction efficiency(E%)and partition coefficient (Kd)

3.6 無機鹽的回收

將富含(NH4)2SO4的下相溶液，加入甲醇后能夠?qū)o機鹽結(jié)晶回收。當(dāng)甲醇與下相溶液的體積比為2 時，回收率能夠達(dá)到91.00%，再增加甲醇，回收率增大的不是很明顯。

圖6 甲醇與鹽相的體積比對(NH4)2SO4回收率的影響Fig.6 Effect of volume ratio of methanol added to bottom phase on recovery rate of (NH4)2SO4

3.7 與其它雙水相分離純化銀杏黃酮的對比

與傳統(tǒng)的PEG、表面活性劑等雙水相體系相比，離子液體鹽雙水相體系在分離純化銀杏黃酮時，萃取效率高，粘度低。

表1 銀杏黃酮在不同雙水相體系中的萃取效率及其上、下相的粘度Table 1 The extraction efficiency and viscosity of different ATPSs

4 結(jié)論

［C8mim］［N(CN)2］/(NH4)2SO4雙水相體系分離純化銀杏黃酮時萃取效率高，體系的粘度低。體系由18.52% ［C8mim］［N(CN)2］，25.93%(NH4)2SO4構(gòu)成，加入1.5 mmol NaCl，在室溫下進(jìn)行萃取時萃取效率最佳。同時實驗過的富含(NH4)2SO4下相溶液，加入甲醇結(jié)晶回收。

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