復合酶法提取黃秋葵嫩果多酚的工藝優化

汪殿蓓，李建華

特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室 湖北工程學院，孝感 432000

黃秋葵(Abelmoschus moschatus L.)是錦葵科一年生的草本植物，原產于非洲，果為蒴果，先端細尖略彎曲，形似羊角，又稱羊角豆。黃秋葵果實是一種具有較高營養價值和顯著保健功能的新型保健蔬菜［1］，黃秋葵嫩果中蛋白質、總糖、多糖含量豐富［1，2］，研究表明適量攝入黃秋葵果實粉能顯著提高衰老小鼠的免疫功能和抗疲勞能力［3］，說明黃秋葵嫩果中生物活性成分豐富。目前對黃秋葵嫩果中多糖［4］、果膠［5］等成分的提取工藝均有研究報道，但黃秋葵嫩果中多酚的提取工藝還未見報道。

植物多酚又稱植物單寧，是植物體內的復雜酚類次生代謝產物，具有抗氧化、抑制酶活性、抑菌、抗致突變、消炎、降血壓等多種生物活性，主要存在于植物體的表皮、根、葉、殼和果肉中［6-8］。多酚在食品及其他領域有著廣泛的用途，從植物多酚中篩選功能食品或藥品成分是近年研究的熱點。本文以纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶構成復合酶，采用復合酶法對黃秋葵嫩果中多酚提取工藝進行探討，以期更進一步促進黃秋葵的開發與利用。采用酶法提取植物活性成分具有操作效率高、條件溫和、無污染的特點［9］。

1 材料與儀器

2012 年4 月將黃秋葵種子播于湖北工程學院苗圃內，7 月份采摘嫩果，冷凍保存備用。沒食子酸溶液、Folin-Ciocalteau 試劑(FC 試劑，自制，磷鉬鎢酸-碳酸鈉顯色體系)、蒸餾水、碳酸鈉溶液(分析純)、纖維素酶(寧夏夏盛實業集團公司)、甘露聚糖酶(寧夏夏盛實業集團公司)、果膠酶(湖州禮來生物技術有限公司)。

202-2 型干燥箱(上海市實驗儀器總廠);PL203型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);H-4 數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);Cary 60 紫外可見分光光度計(安捷倫科技(中國)有限公司);康佳BCD-138UTS 冰箱(安徽康佳電器有限公司);ZWL-08B 臺式離心機(金壇市鴻科儀器廠);康麗SO200-A 多功能攪拌機(順德市寶鋒電器廠);100～1000 μL 微量移液器。

2 實驗方法

2.1 最大吸收波長的檢測

將1.0 mL 50 μg/mL 沒食子酸溶液加入1.0 mL FC 試劑(1 ∶1)，然后加入3.0 mL 7.5%Na2CO3，蒸餾水定容至10.0 mL。20 ℃避光靜置l h，在分光光度計下進行500～900 nm 掃描，確定最大吸收波長。

2.2 標準曲線的制作

參照鄧義書等［8］的方法，測定并繪制沒食子酸標準曲線。取1.0 mL 提取液于10.0 mL 試管中，加水3.0 mL，加0.2 mL FC 試劑，混勻，在30 sec 至8min 內加入0.6 mL 7.5% Na2CO3溶液，混勻，定容至10.0 mL，于45 ℃保溫40 min，在測定的最大吸收波長下比色，每樣重復測量3 次，取平均值。

2.3 三種酶單獨使用時的最佳用量

酶發揮催化作用需要適當溫度和pH 值條件，考慮到多酚在高溫下容易氧化分解，調整pH 值會加入其它物質，在后續分離純化中不易去凈，本研究選取酶反應溫度為40 ℃，自然pH 值(約為6.0)。

取45 只燒杯，分別加入1.00 g 黃秋葵嫩果粉末后，再分別加入30.0 mL 質量百分比為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的纖維素酶(C1～C5)、甘露聚糖酶(H1～H5)和果膠酶(M1～M5)，自然pH值，置于40 ℃恒溫搖床中，200 rpm 提取1 h，迅速冷卻至室溫過濾，測定多酚含量(n=3)，據此確定纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶單獨使用時的最佳用量。

2.4 正交試驗設計

黃秋葵嫩果去雜后均漿，均質狀態下稱取3.00 g 置于50.0 mL 的試管中，加純水27.0 mL，45 ℃提取2 h，離心，取上清液按上述方法測定黃秋葵多酚提取量。在30.0 mL 提取體系中，設計3 因素3 水平的正交試驗，選用正交表L9(34)進行試驗設計(表2)，確定纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶這三種酶的最佳組合比例(用量)。

2.5 響應曲面法優化復合酶提取工藝

在復合酶提取法中，提取時間、液料比以及提取溫度對多酚的提取有較大的影響。在正交試驗確定復合酶用量的基礎上，用Design-Expert 軟件中的中心組合設計(Central Composite Design，CCD)模塊，設計了一組3 因素3 水平的實驗(full CCD 設計)，以確定提取時間、液料比以及提取溫度對黃秋葵多酚提取的影響(表1)。

準確稱取1.00 g 黃秋葵嫩果粉末，按照中心組合設計試驗中設置的不同提取條件分別進行浸提，離心收集各個提取條件下得到的提取液，測定其多酚含量。每個處理重復3 次。

表1 試驗的因素及水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2.6 數據處理

實驗數據采用Design Expert 軟件進行多元回歸及方差分析。

3 結果與分析

3.1 最大吸收波長

實驗結果表明多酚(以沒食子酸表示)在可見光區有一明顯的吸收峰，儀器隨機軟件顯示，波峰所在波長為768 nm。

3.2 沒食子酸標準曲線

以吸光度值y 與沒食子酸標準溶液濃度(x，mg/mL)繪制沒食子酸標準曲線，其回歸方程為y=0.015x+0.061，決定系數R2值為0.9950，表明沒食子酸質量濃度與吸光度值具有良好的線性關系。

圖1 三種酶在不同濃度下的多酚提取量Fig.1 Concentrations of polyphenols extracted by three enzymes at five concentrations

3.3 三種酶的最佳反應濃度

在不同濃度的纖維素酶(C1～C5)、甘露聚糖酶(H1～H5)和果膠酶(M1～M5)作用下，黃秋葵多酚含量如圖1，結果顯示，三種酶在濃度C3、H3、M3，即質量百分比為1.0%、濃度為10.0 mg/g 時提取的多酚含量最高。

3.4 正交試驗結果

在30.0 mL 提取體系中，以三種酶單獨作用時的最佳量即濃度1.0%(10.00 mg/g)為基準，設置3個水平—1.0%、2.0%、3.0%進行正交試驗，結果表明，纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶的最佳組合為C2H3M1，即每g 提取體系中加纖維素酶0.0050 萬單位，甘露聚糖酶0.0075 萬單位，果膠酶0.0025 萬單位。

表2 正交設計及試驗結果Table 2 Design and test results of orthogonal experiments

3.5 響應曲面分析試驗方案及結果

以提取溫度、液料比和提取時間為變量，用響應曲面法分析由2.0%纖維素酶、3%甘露聚糖酶和1%果膠酶組成的多酶復合體提取黃秋葵嫩果多酚的最佳工藝條件。以每克黃秋葵嫩果中總多酚提取量為響應值(Y)，響應曲面分析試驗設計及結果如表3 所示。

表3 響應曲面分析試驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface analysis

3.6 模型的建立及顯著性檢驗

應用Design expert 軟件對表3 中的數據進行多元回歸擬合，得到黃秋葵嫩果多酚提取量對提取溫度(A)、提取時間(B)、和液料比(C)的三次多項回歸方程:

對所得模型進行顯著性檢驗，回歸方程系數及其顯著性檢驗結果見表4。從表4 可以看出，該回歸模型P＜0.01，表明回歸方程模型極顯著;失擬項P=0.966 ＞0.05，表明失擬項不顯著。方程的復相關系數R2為0.9930，為0.9814，說明模型回歸方程的擬合程度良好，可用來分析和預測黃秋葵多酚的提取工藝。

從表4 的方差分析可知，回歸模型的一次項中A(溫度)、B(液料比)差異極顯著，二次項中AC 項差異顯著，BC、A2、B2、C2差異極顯著，三次項中A2B、A2C 差異極顯著，C(時間)項差異不顯著，這表明不同的提取因素與黃秋葵多酚提取量不是簡單的線性關系。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of fitted cubic polynomial model

注:＊＊差異極顯著，* 差異顯著。Note:＊＊ indicated very significant difference，* indicated significant difference.

3.7 響應曲面分析與工藝優化

根據回歸方程繪出響應曲面圖，以確定提取溫度、提取時間和液料比三個因素對黃秋葵多酚提取效果的影響及這三個因素間的相互作用，響應曲面圖如圖2 和圖3。提取溫度與液料比之間交互作用不顯著。

圖2 提取溫度和提取時間的響應曲面圖Fig.2 Response surface plot of cross-interaction between extraction temperature and time on extraction yield of polyphenol from okra

圖3 液料比和提取時間的響應曲面圖Fig.3 Response surface plot of cross-interaction between liquid-solid ratio and extraction time on extraction yield of polyphenol from okra

響應面可以直接反應出各因子對響應值影響的大小，響應曲面法的圖形是響應值Y 對應自變量A、B、C 構成的一個三維空間圖，從響應面分析圖上可以看出其在反應過程中的相互作用而確定合適的工藝條件［10］。如果響應面坡度相對平緩，表明其可以忍受處理條件的變異，而不影響到響應值的大小。相反，如果坡度非常陡峭，那么表明響應值對于處理條件改變非常敏感。由圖2 和圖3 可以看出，提取溫度和液料比對黃秋葵多酚提取具有極顯著影響，提取溫度與提取時間、液料比與提取時間的兩兩交互作用顯著，提取溫度與提取時間、提取時間與液料比三次方項之間存在著顯著的交互作用。

根據響應曲面優化的結果，黃秋葵嫩果多酚提取優化工藝條件為:提取溫度44.97 ℃，液料比(mL∶g)58.80∶1，提取時間3.99 h，預測多酚提取值為29.193 mg/g。

3.8 驗證實驗

對響應曲面法獲得的優化工藝條件進行驗證，鑒于實際操作的可行性，提取工藝條件改為提取溫度45 ℃，液料比(mL∶g)60∶1，提取時間4 h，實驗測得黃秋葵嫩果多酚含量為29.156 mg/g，與預測值非常接近，說明通過響應曲面法優化的黃秋葵多酚提取工藝具有實踐應用價值，是有效可行的。

4 結論

本試驗在單因素實驗和正交試驗的基礎上，獲得2.0%纖維素酶、3.0%甘露聚糖酶和1.0%果膠酶的多酶復合體;應用響應曲面分析法對復合酶法黃秋葵嫩果多酚提取工藝進行優化，得到黃秋葵嫩果多酚提取量對提取溫度(A)、提取時間(B)、和液料比(C)的三次多項回歸方程:Y=-610.496 +34.129 A -1.604 B +239.13 C -12.988 AC +0.109 BC -0.419 A2+0.013 B2+1.845 C2-0.000024 A2B+0.164 A2C，該模型具有良好的預測效果。

根據回歸分析結果得到復合酶法提取黃秋葵嫩果多酚的優化工藝為:提取溫度44.97 ℃，液料比(mL∶g)58.80∶1，提取時間3.99 h，預測多酚提取值為29.193 mg/g。通過實踐驗證，該工藝條件有效可行，具有推廣應用價值。復合酶法提取植物活性成分，具有無污染、條件溫和、抽取效率高的特點，而且本試驗中復合酶采用水溶解，兼顧了食品安全，因此該工藝可為黃秋葵多酚的批量生產提供參考。

1 Xue ZZ(薛志忠)，Liu SY(劉思雨)，Yang YH(楊雅華).Research progress on application value and development of Okra.Storage Process(保鮮與加工)，2013，13(2):58-60.

2 Huang AG(黃阿根)，Chen XH(陳學好)，Gao YZ(高云中)，et al.Determination and analysis of ingredient in Okra.J Food Sci(食品科學)，2007，28:451-455.

3 Olatunji II，Ijiwole T，Awobajd FO.Evaluation of the deleterious effect of aqueous fruit extract of Abelmoschus esculentus(okra fruit)on some male reproductive parameters in Sprague dawley rats.J Phytol，2009，1:461-468.

4 Zhu ZP(祝子坪)，Li N(李娜).Study on the detection method of okra polyphenols content.Jiangsu Agric Sci (江蘇農業科學)，2012，40:241-242.

5 Huang JB(黃劍波)，Sun ZH(孫哲浩)，Zhang YH(張英慧)，et al.Study on extraction of pectin from Okra.Mod Food Sci Technol (現代食品科技)，2011，23(2):51-53.

6 Shi EH(石恩慧)，Guo KJ(郭凱軍)，Li H(李紅)，et al.Castanea mollissima Blume polyphenols:extraction technology optimization and its antioxidant activity.Acta Zoonutri Sin(動物營養學報)，2013，25:406-411.

7 Zhang HJ(張海均)，Jia DY(賈冬英)，Sun H(孫慧)，et al.Inhibitory effect of polyphenol extract from pomegranate peel and its purified fractions on α-glucosidase activity.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2012，24:1253-1256.

8 Deng YS (鄧義書)，Bao HR(包海蓉)，Qi ZG(齊知耕).Comparative study between different extraction methods of total polyphenols from mulberry dregs.Hunan Agric Sci(湖南農業科學)，2010，15:106-108.

9 Lin ZQ(林志欽)，Peng B(彭彬)，Zeng SX(曾紹校)，et al.Optimization of enzymatic extraction of flavonoids in Lotus germ by response surface analysis.J Chin Inst Food Sci Technol(中國食品學報)，2012，12(3):45-51.

10 Shi TY(石太淵)，Mao HY(毛紅燕)，Ma T(馬濤)，et al.Optimization of ultrasound-assisted extraction process of flavonoids from Liao Schisandra chinensis (Turcz.)Bail.China Brew (中國釀造)，2011，227(2):96-99.