排風藤提取物中東莨菪苷對神經細胞的抗氧化活性研究

孔玉珊，黃少蘭，謝明霞，薛艷紅，鄒 坤，劉士平

天然產物研究與利用湖北省重點實驗室 三峽大學生物與制藥學院，宜昌 443002

排風藤(Solanum cathayanum)又稱千年不爛心、蜀羊泉等，是我國特有的一種茄屬植物，主要分布于三峽流域及神農架、恩施和湘西等地［1］。作為一種民間草藥，排風藤具有清熱利濕、解毒消腫的功效，在三峽庫區具有多年的使用歷史［2］。本實驗室的前期研究表明，排風藤的部分提取物不僅可殺菌抗炎、保肝護膽［3］，而且對神經細胞具有較好的抗氧化保護能力［3］，具有可作為治療神經退行性疾病(如帕金森癥，阿爾茨海默病和亨廷頓氏病等)藥物的潛能［4］。為進一步探討排風藤提取物在神經元氧化損傷中的保護作用，本實驗室從排風藤中分離出9個單體化合物［1，5］，經結構鑒定其中一種為東莨菪苷(Scopolin)。本文分析了東莨菪苷的細胞毒性，進行了過氧化氫脅迫下人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y 的氧化損傷保護作用分析，試驗結果表明東莨菪苷具有有效的抗H2O2介導的氧化損傷作用，具有緩解細胞膜損傷、恢復超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物質的含量，為新型神經退行性疾病藥物的開發和設計提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

排風藤采自湖北恩施，經三峽大學生物與制藥學院陳發菊教授鑒定為Solanum cathayanum。人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y 由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心惠贈。

1.2 藥品和儀器

實驗中使用的藥品和試劑有:胰蛋白酶(美國GIBCO 公司)，四氮唑藍(MTT)(美國AMRESCO 公司)，新生小牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，過氧化氫(H2O2，分析純，國藥集團)，LDH、SOD、GSH 檢測試劑盒(上海寶曼生物公司)。其中D-MEM/F-12 完全培養基內含2.2 mg/mL NaHCO3，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素，15%新生小牛血清。基礎培養基將新生小牛血清降為3%。所用的儀器有酶聯免疫檢測儀(Genios Tecan);CO2培養箱(日本三洋公司)，LD4-2A 離心機(北京醫用離心機廠)，XDS-1B 倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)和96 孔板(美國Corning 公司)。

1.3 東莨菪苷的分離與鑒定

取6.5 kg 排風藤干燥全草粉碎，95%乙醇回流提取3 次，每次2～3 h，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味后用石油醚脫脂。脫脂后的水層用4% HCl 冷浸3 次，用Na2CO3調至成不同的pH(7、10、12)后經氯仿萃取三次，最后水層再用正丁醇萃取得正丁醇部位(260.2 g)。將正丁醇部位水懸浮后，其水溶部分經大孔吸附樹脂和反相硅膠柱層析，經HPLC 制備獲得30 mg 樣品。將該化合物進行硅膠薄層色譜、重氮化氨基苯磺酸反應、Molish 反應和核磁共振后確定其結構。

1.4 細胞培養及H2O2損傷模型的建立

SH-SY5Y 細胞用D-MEM/F-12 完全培養基于37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱中培養。待細胞80%～90% 鋪滿瓶底時進行傳代、轉板，貼壁細胞用0.25%的胰蛋白酶進行消化，傳代按1∶3 比例進行。H2O2損傷模型的建立按照［3］的方法進行。

1.5 東莨菪苷對神經細胞毒性檢測

取對數生長期的SH-SY5Y 細胞以1 ×105個/mL 的濃度接種于96 孔板，100 μL/孔，培養24 h 貼壁后棄去舊培養基，加入濃度為0.1、1、10、100、1000 μM 的藥物(含3%血清的培養基配制)，同時設空白對照組，每組設6 次重復，繼續培養24 h，MTT 比色法在492 nm 處檢測吸光值并計算細胞存活率［6-8］(存活率=處理組OD 值/空白組OD 值×100%)。

1.6 東莨菪苷對神經細胞抗氧化保護活性及量效關系分析

根據毒性實驗結果，選取100 μM 以下的濃度先進行初篩。棄去舊培養基后，模型組及給藥組加入濃度為700 μM 的雙氧水(無血清培養基配制)，培養12 h 后用MTT 比色法檢測細胞存活率。量效關系分析中將濃度設置為0.01、0.1、1、10、100 μM，同時設空白組、模型組及正對照維生素E(VE)組(VE 的濃度為5 mg/mL)。

1.7 乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)檢測

利用黃遞酶法分別檢測細胞內外的LDH，計算漏出率。LDH 漏出率=［細胞外值/(細胞外值+細胞內值)］×100%。LDH、SOD、GSH 檢測的具體操作均按上海寶曼生物公司的試劑盒說明進行。

1.8 統計學處理

2 結果與分析

2.1 東莨菪苷的結構鑒定

分離純化后的樣品呈白色粉末狀，mp.203～204 ℃。硅膠薄層色譜在365 nm 紫外燈下觀察呈藍色熒光斑點，UVλMeOHnm:203 nm、275 nm，提示該化合物有較大的共軛體系，重氮化氨基苯磺酸反應呈陽性，提示該化合物可能是香豆素類化合物。Molish 反應呈陽性，原位酸水解只檢測到葡萄糖。ESIMS m/z:355 ［M+H］+。1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δH:7.97 (1H，d，J=9.5 Hz，H-4)，7.29 (1H，s，H-8)，7.16 (1H，s，H-5)，6.33 (1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，5.00 (1H，d，J=6.0 Hz，H-1')，3.81(3H，s，6-OCH3);13C NMR (DMSO-d6，100 MHz)δC:160.4 (C-2)，149.8 (C-7)，148.8 (C-9)，145.9(C-6)，144.1 (C-4)，113.4 (C-5)，112.2 (C-10)，109.6 (C-3)，105.5 (C-8)，102.9 (C-1')，77.0 (C-3')，76.2 (C-5')，72.9 (C-2')，69.5 (C-4')，60.6(C-6')，55.9 (6-OCH3)。以上數據與文獻［9］報道一致，故鑒定化合物為東莨菪苷(scopolin)，其化學結構式見圖1。

圖1 東莨菪苷的化學結構Fig.1 Chemical structure of scopolin

2.2 東莨菪苷對神經母瘤細胞生長的影響

為明確東莨菪苷對神經細胞的生長是否具有毒害作用，并尋找到合適的藥物濃度范圍，試驗中我們考察了不同濃度的單體對SH-SY5Y 細胞存活率的影響。結果顯示(表1)東莨菪苷對SH-SY5Y 細胞的毒性作用隨著濃度的增加而增強:當濃度達到100 μM 時，細胞的生長會受到影響;而當濃度升高到1000 μM 時，細胞的存活率僅有對照的82.23%。統計分析還表明，當用0～100 μM 濃度的東莨菪苷進行處理時，其對SH-SY5Y 細胞的毒害作用較小，因此選用此濃度范圍進行抗氧化保護作用分析。

表1 東莨菪苷對SH-SY5Y 細胞生長的影響Table 1 Effect of scopolin on growth of SH-SY5Y cells

2.3 東莨菪苷的抗氧化能力分析

在建立了700 μM 雙氧水氧化脅迫模型的基礎上，我們分析了東莨菪苷對人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y 的抗氧化活性分析。MTT 比色法實驗結果顯示東莨菪苷對雙氧水損傷的SH-SY5Y 細胞具有明顯的保護作用。在0.01～100 μM 濃度范圍內東莨菪苷均顯示出很好的抗氧化活性，保護細胞免于遭到雙氧水的氧化損傷，其效果優于陽性對照VE(圖2)。但在所試驗的濃度范圍內，其量效關系不明顯。

圖2 東莨菪苷對SH-SY5Y 細胞的抗氧化保護作用Fig.2 Protective effect of scopolin on SH-SY5Y cells under H2O2oxidative stress

2.4 LDH、SOD、GSH 檢測

為進一步分析排風藤提取物東莨菪苷對神經細胞的氧化保護作用機理，我們分別測定了SH-SY5Y細胞在不同東莨菪苷濃度(0.001、0.01 和0.1 μM)下的LDH、SOD、GSH 值(圖3)。實驗結果表明，在細胞正常生長時，LDH 的活性主要集中在細胞內，可700 μM 的H2O2使得LDH 的漏出率達到近30倍(圖3A)，即H2O2導致神經細胞的氧化損傷部分原因是由于細胞膜受損，使得胞內LDH 的活性降低，胞外LDH 活性增高。但東莨菪苷可與陽性對照VE 一樣，起到部分降低LDH 漏出率的作用，在濃度超過0.01 μM 時效果明顯(圖3A)，說明東莨菪苷可以降低因H2O2導致的細胞膜損傷，從而起到保護神經細胞的作用。

在H2O2存在下，SH-SY5Y 細胞的SOD 酶活顯著下降(圖3B)。VE 可以顯著恢復其活性(恢復率:68%)，而東莨菪苷對其也有很好的恢復效果(圖3B)，在0.1 μM 時SOD 酶活可以恢復到正常生長的63%。GSH 活性檢測的結果和SOD 類似，H2O2使得GSH 的活性下降80%以上(圖3C)，VE和0.1 μM 的東莨菪苷使得其活性得以部分恢復，恢復度達40%以上(圖3)。這一系列實驗結果表明，東莨菪苷對神經細胞的抗氧化保護作用，除了可以減少膜損傷之外，還可以顯著提高抗氧化酶的活性。

3 討論

活性氧可誘導神經細胞發生凋亡，是造成許多退化性神經系統疾病的一種重要誘因。故找到合適的抗氧化劑，保護神經元免受氧化應激損傷，是防治該類疾病的有效途徑。前期研究表明排風藤的提取物對神經細胞具有較好的抗氧化保護能力［3］，本文在前期研究的基礎上從排風藤中分離了一個單體化合物——東莨菪苷，并探討了其對神經母瘤細胞SH-SY5Y 的抗氧化保護活性，結果表明在0.01～100 μM 濃度范圍內東莨菪苷均顯示出很好的抗氧化活性，其效果甚至優于陽性對照VE，因此為神經退行性疾病的藥物設計提供了一定的參考價值。

圖3 東莨菪苷對神經細胞LDH 漏出率(A)、SOD 酶活(B)及GSH(C)活性影響Fig.3 Influence of scopolin on LDH leakage (A)，SOD (B)and GSH (C)activities of SH-SY5Y cells

作為一種潛在藥物，東莨菪苷具有抗炎、鎮痛的效果，可用于治療風濕痛和神經痛等疾病，顯示出很大的潛在藥用價值［1-3］。但是其對神經細胞的抗氧化保護作用機理卻很復雜，本文研究結果表明，東莨菪苷既可以一定程度上保護細胞膜免遭損傷，又可以恢復神經細胞抗氧化酶(SOD)或抗氧化劑(GSH)的活性，這些生理指標均接近正對照VE。其中，不管是VE 還是東莨菪苷，其對SOD 和GSH的恢復度均分別可達到正常生長的60%和40%(圖3);相比之下，東莨菪苷和VE 對LDH 漏出率的作用有限，是正常生長的15～20 倍(圖3)，反映細胞膜的損傷度仍較高。這一些說明東莨菪苷介導的神經細胞的抗氧化作用，機制復雜多樣，其詳細機理還有待進一步研究。

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