黃芩苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠TLRs/MyD88 通路的作用研究

鄒 穎，遲宏罡，歐陽霖芮，石 敏，蔡碧茉，伍俏璐，戴世學(xué)，馮錦山，趙 兵，鄭學(xué)寶*

1廣東醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)教研室;2 廣東醫(yī)學(xué)院中美腫瘤研究所;3廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，東莞 523808;4 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院急診科，廣州 510515

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克隆恩病(crohn's disease，CD)兩種類型，是以侵及結(jié)腸黏膜且以潰瘍?yōu)橹鞯穆苑翘禺愋匝仔阅c病，雖然病因和發(fā)病機(jī)制目前仍然未完全闡明，但易感個(gè)體體內(nèi)的環(huán)境因素改變引發(fā)的腸道免疫系統(tǒng)對(duì)腸道正常菌群的免疫耐受失衡已得到廣泛的認(rèn)可［1，2］。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為模式識(shí)別受體，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中的固有免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用。近年來，大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)TLRs 在IBD 患者和結(jié)腸炎動(dòng)物模型中的表達(dá)都有顯著的升高［3］，提示TLRs 在IBD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。TLRs 識(shí)別外源性配體或內(nèi)源性分子后，可將識(shí)別信號(hào)傳遞給髓樣細(xì)胞分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)接頭蛋白，MyD88 再將該信號(hào)傳遞給核因子-κB(nuclear factorkappa B，NF-κB)并引起NF-κB 活化，釋放炎癥因子和趨化因子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤而參與炎癥反應(yīng)［4］。因此，阻斷TLRs/MyD88 可緩解IBD 腸道的炎癥反應(yīng)。

黃芩苷(baicalin)是唇形科植物黃芩的有效成分之一，其藥理作用廣泛，具有清熱解毒、抗炎、利膽、降壓、利尿、抗變態(tài)反應(yīng)等多方面的作用［5］。近年來研究證實(shí)黃芩苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠具有一定的保護(hù)作用［6］，但機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究擬從TLRs/MyD88 通路為出發(fā)點(diǎn)，深入探討黃芩苷對(duì)結(jié)腸炎保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6 小鼠(雌性，18～20 g)，購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):2007-0081。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

黃芩苷(98%)，購于西安源森生物科技公司，生產(chǎn)批號(hào):YS 121121;DSS 購于美國MP Biomedicals生物公司;Trizol、RNase inhibitor、RT(逆轉(zhuǎn)錄)試劑盒和SYBR GreenERTMqPCR SuperMix Universal 均購自美國Invitrogen 公司;小鼠IL-6 和TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購于美國R＆D 公司;髓過氧化物酶(MPO)活性檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

C57BL/6 小鼠30 只，隨機(jī)分為3 組:空白對(duì)照組(n=10)、模型組(n=10)和黃芩苷組(n=10)。空白對(duì)照組小鼠不做處理;模型組及黃芩苷組小鼠每日自由飲用3.5% DSS 溶液，黃芩苷灌胃劑量為30 mg/kg 體重，共7 d;7 d 后處死全部小鼠，留取結(jié)腸組織3 份，其中1 份置于10%中性甲醛中保存，另外2 份保存于-80 ℃冰箱中用于Real-time PCR 和ELISA 檢測(cè)。

1.4 DAI 評(píng)分

實(shí)驗(yàn)期間觀察并記錄大鼠體質(zhì)量、大便性狀、血便情況，DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+血便分?jǐn)?shù))/3;DAI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下［7］:0 分，體質(zhì)量無下降，大便性狀正常，大便隱血陰性;1 分，體質(zhì)量下降1%～5%，大便松散，大便隱血(+);2 分，體質(zhì)量下降5%～10%，大便非常軟但成形，可見肉眼血便(++);3 分，體質(zhì)量下降10%～15%，大便性狀為稀便，可見肉眼血便(+++)，4 分，體質(zhì)量下降＞15%，大便性狀為較重稀便，可見肉眼血便(+++)。

1.5 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分

結(jié)腸組織在10%中性甲醛中固定24 h 以上，組織脫水、包埋、切片，常規(guī)HE 染色，電子顯微鏡下觀察并根據(jù)Neurath［8］等的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分:0 分:未見明顯病理改變;1 分:10%高倍視野中，呈低水平淋巴細(xì)胞浸潤，腸絨毛結(jié)構(gòu)沒有破壞;2 分，10%～25%高倍視野中，呈中等水平淋巴細(xì)胞浸潤，腸隱窩加深，腸壁增厚但未侵及肌層，未見潰瘍;3 分，25%～50%高倍視野中，呈高水平淋巴細(xì)胞浸潤，血管增生，腸壁增厚并且侵及肌層，未見潰瘍;4 分，明顯淋巴細(xì)胞浸潤，血管增生伴腸隱窩加深變形，腸壁增厚且侵及肌層，見潰瘍。

1.6 結(jié)腸組織MPO 活性檢測(cè)

具體方法參照MPO 活性檢測(cè)試劑盒說明書操作。

1.7 結(jié)腸組織黏膜IL-6 和TNF-α 濃度檢測(cè)

具體方法參照ELISA 檢測(cè)試劑盒說明操作。

1.8 Real-time PCR 法檢測(cè)結(jié)腸組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA 表達(dá)水平

結(jié)腸組織總RNA 抽提按Trizol 說明書進(jìn)行，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的濃度和純度后，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。TLR2:上游引物，5'-TCCTGGCTCAAAAAGCAGTT-3'，下 游 引 物，5'-ACATAGCCCACACCGTTCTC-3';TLR4:上 游 引 物，5'-TGGTTCACTGGAACACCAAA-3'，下游引物，5'-AGCAAGGGT CGAAGTTAGCA-3';MyD88:上游引物，5'-TGGCCTTGTTAGACCGTGA-3'，下 游 引 物，5'-AAGTATTTCTGGCAGTCCTCCTC-3';β-actin:上游引物，5'-GACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'，下游引物，5'-AGGAAGGCTGGAAAAGA-GCC-3'。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃，10 min，95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，72 ℃，1 min，共40 循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-ΔΔCt分析法。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組間比較采用單向方差分析(one-way ANOVA)，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)多重比較采用LSD方法檢驗(yàn)，如方差不齊時(shí)采用近似F 檢驗(yàn)Welch 法進(jìn)行方差分析，多重比較采用Dunnett’s T3 方法檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況及DAI 評(píng)分

空白對(duì)照組小鼠反應(yīng)較靈敏，毛發(fā)光澤，體重持續(xù)增長，大便正常，飲食正常。結(jié)腸炎模型組小鼠在DSS 造模3 天后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、懶動(dòng)，飲食減少，體毛失去光澤凌亂，體重明顯減輕、稀便，肛周污穢，5 天后出現(xiàn)明顯血便。黃芩苷治療組小鼠未見明顯的肉眼血便，癥狀明顯輕于模型組小鼠;模型組小鼠的DAI 評(píng)分逐漸升高，與空白對(duì)照組比較差異有顯著意義，而黃芩苷治療組小鼠的DAI 水平明顯低于模型組，黃芩苷組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖1)。

圖1 黃芩苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠DAI 評(píng)分的影響Fig.1 Effects of baicalin on the DAI score of experimental colitis in mice

2.2 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分

模型組小鼠與對(duì)照組相比，小鼠結(jié)腸黏膜不完整，病變累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層，少數(shù)可達(dá)漿膜層，可見多灶性淺潰瘍有出血和潰瘍形成，炎性細(xì)胞浸潤明顯。黃芩苷治療組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，腺體破壞較輕，炎性細(xì)胞浸潤程度較輕，病理組織學(xué)評(píng)分與模型組比較差異有顯著意義(P＜0.05)(圖2 和圖3)。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織HE 染色(×200)Fig.2 HE staining of colonic tissues of all groups of mice(×200)

圖3 黃芩苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分的影響Fig.3 Effects of baicalin on the histological score of experimental colitis in mice

2.3 MPO 活性

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織MPO活性顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);黃芩苷可以有效的降低MPO 的活性，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4)。

圖4 黃芩苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織MPO 活性的影響Fig.4 Effects of baicalin on the MPO activity of experimental colitis in mice

2.4 結(jié)腸組織IL-6 和TNF-α 濃度表達(dá)水平

ELISA 結(jié)果顯示，DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型后，小鼠結(jié)腸組織中IL-6 和TNF-α 的表達(dá)均顯著升高，與空白對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(圖5A、B);黃芩苷能夠抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中IL-6 的表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(圖5A)，黃芩苷治療組中的TNF-α 的表達(dá)也得到有效的抑制，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖5B)。

圖5 黃芩苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織IL-6 和TNFα 濃度的影響Fig.5 Effects of baicalin on the concentrations of IL-6 and TNF-α in colonic homogenates of experimental colitis in mice

2.5 結(jié)腸組織TLR2、TLR4 和MyD88 mRNA 表達(dá)水平

Real-time PCR 結(jié)果顯示，DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中TLR2、TLR4 和MyD88 mRNA 表達(dá)水平顯著升高，與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，黃芩苷治療后，能夠顯著抑制TLR2、TLR4 和MyD88 mRNA 的表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖6)。

圖6 黃芩苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織TLR2、TLR4和MyD88 mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of baicalin on the mRNA expression levels of TLR2，TLR4 and MyD88 in colon tissue of experimental colitis in mice

3 討論

本研究觀察了黃芩苷對(duì)DSS 誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型的保護(hù)作用，并從TLRs/MyD88 通路的角度探討了黃芩苷的作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)黃芩苷能夠緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型的炎癥反應(yīng)，抑制結(jié)腸炎模型中TLRs/MyD88 通路中過表達(dá)的TLR2、TLR4 和MyD88 mRNA 的水平。

DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型是一種經(jīng)典的造模方法，其病理表現(xiàn)與人類的UC 非常相似，本實(shí)驗(yàn)通過用黃芩苷進(jìn)行治療，結(jié)果顯示黃芩苷能有效的緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型的癥狀，降低腹瀉和血便的程度，抑制腸道的炎癥反應(yīng)，降低MPO 的活性，保護(hù)腸道黏膜，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與劉萍等［6］的研究結(jié)果一致，提示黃芩苷對(duì)結(jié)腸具有一定的保護(hù)作用。TNF-α 和IL-6 是重要的具有多種生物功能的促炎細(xì)胞因子，主要由激活的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，它們?cè)谀c道黏膜的炎癥和免疫反應(yīng)中起了非常重要的作用。在活動(dòng)期UC 患者的結(jié)腸黏膜組織TNF-α和IL-6 的表達(dá)相對(duì)于緩解期患者或者正常人中的表達(dá)顯著增多，被認(rèn)為是公認(rèn)的介導(dǎo)IBD 的關(guān)鍵細(xì)胞因子，參與了IBD 的發(fā)病［9］。我們的研究結(jié)果證實(shí)，DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型結(jié)腸黏膜中TNF-α 和IL-6 的表達(dá)升高，黃芩苷能有效的抑制結(jié)腸組織中TNF-α 和IL-6 的表達(dá)，說明黃芩苷能夠抑制炎癥因子的釋放，從而限制炎癥反應(yīng)。

病原微生物及其細(xì)胞壁均具有一類稱為病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMP)的特殊結(jié)構(gòu)，TLR 就是通過識(shí)別PAMP 介導(dǎo)宿主相關(guān)細(xì)胞因子的分泌和天然免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，稱為模式識(shí)別受體。TLR2 可識(shí)別大部分現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的PAMP 結(jié)構(gòu)，脂蛋白類、脂磷壁酸酯類、肽多糖和酵母多糖等，TLR4 主要識(shí)別LPS 及具有保守類脂A結(jié)構(gòu)的衍生物等。研究發(fā)現(xiàn)在IBD 患者和結(jié)腸炎動(dòng)物模型中，TLR2 和TLR4 的表達(dá)均顯著升高，說明激活的TLRs 信號(hào)通路參與了IBD 的發(fā)病。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型的結(jié)腸組織中TLR2 和TLR4 的mRNA 表達(dá)顯著升高，TLR2 和TLR4 的過表達(dá)可能是由于過度的固有免疫反應(yīng)和腸道菌群的失衡引起的，因此促進(jìn)的IBD的發(fā)生。

MyD88 是含有TLR 結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，是TLR信號(hào)通路的下游信號(hào)因子，在TLR 信號(hào)通路中有關(guān)鍵性的作用。TLRs 識(shí)別PAMPs 后，胞質(zhì)中Toll 的TLR 結(jié)構(gòu)域與MyD88 羧基末端相互作用，可引起NF-κB.的激活和轉(zhuǎn)位，促使炎性細(xì)胞因子的合成與釋放，從而誘發(fā)機(jī)體本身的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸炎小鼠模型中敲除TLR4 和MyD88 基因，小鼠可表現(xiàn)出死亡率降低、受損黏膜的自動(dòng)修復(fù)、腸道出血程度減輕等癥狀［10］，說明抑制MyD88 通路可以功能性的限制腸道的炎癥反應(yīng)。我們的研究結(jié)果證實(shí)，黃芩苷能夠有效的抑制DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型結(jié)腸黏膜TLR2 和TLR4 和MyD88 mRNA 的表達(dá)，提示黃芩苷能夠通過對(duì)TLRs/MyD88 通路的調(diào)控來達(dá)到抑制結(jié)腸的炎癥反應(yīng)起到治療作用的。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)黃芩苷能夠有效的緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型的癥狀，降低炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能是與TLRs/MyD88 通路相關(guān)。

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