大蒜素對小鼠脾細胞雌激素和雄激素受體影響的實驗研究

劉靈燕，董 群

皖南醫學院微生物學與免疫學教研室，蕪湖 241002

大蒜(Garlic)作為調味品在民間廣泛應用，現代科學證明大蒜具有多種有益健康的生物活性:抗氧化、抗細菌、抗寄生蟲、抗腫瘤、降低血脂和抑制血小板聚集等［1-3］。大蒜素是大蒜中的主要生物活性成分，其化學名稱為二烯丙基三硫化物。神經系統、內分泌系統和免疫系統是機體的三大調節系統，這三大系統看似獨立，實際上是一個有著廣泛聯系的有機整體，三者之間相互交織、相互協調、相互影響，構成一個神經-內分泌-免疫網絡［4］。大蒜素對免疫系統影響的研究較多，但是關于大蒜素對神經內分泌系統的影響報道甚少。本實驗室研究發現大蒜素可上調小鼠ACTH 和CORT 的表達［5］，在此基礎上本實驗通過給青年小鼠灌服大蒜素后，觀察小鼠脾細胞上雌激素受體(ERα 和ERβ)和雄激素受體(AR)mRNA 的表達水平變化情況，來探討大蒜素對內分泌系統的調節作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

ICR 清潔雄性和雌性小鼠(批號為SCXK 蘇2007-0001)，體重為18～20 g，6 周齡，由揚州大學比較醫學中心提供。

1.2 實驗藥物

大蒜素膠囊，由江蘇正大清江制藥有限公司生產(批號為H32025683)，規格:20 mg/粒。

1.3 試劑

總RNA 抽提試劑，cDNA 第一鏈合成試劑盒，PCR 試劑，購自北京天根公司;AR、ERα、ERβ、GAPDH 上下游引物，由南京金斯瑞設計;瓊脂糖(加拿大BIO BASIC INC.公司);氯仿(上海博河精細化學品有限公司);異丙醇無錫市展望化工試劑有限公司);無水乙醇(天津市東麗區季明莊工業園區)等。

1.4 主要儀器

PCR 擴增儀(英國Techne 公司);電泳儀(Bio Rad 公司);Gel Doc1000 凝膠成像系統(Bio Rad 公司);高速冷凍離心機(上海良平儀器儀表有限公司);生物安全柜(ESCO 公司);-80 ℃冰箱(中科美菱公司);冰箱(無錫松下冷機有限公司)等。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組

將實驗動物按性別隨機分成3 組實驗組和3 組對照組。

2.2 灌服大蒜素

大蒜素對小鼠用藥的一般劑量為25 mg/kg·d［6］，0.4 mL/只。實驗組小鼠每只分別灌服大蒜素0.4 mL×14 d(25 mg/kg)、0.4 mL×21 d、0.4 mL×28 d，對照組同期分別灌服等體積的生理鹽水。

2.3 取標本

小鼠處死后，無菌取脾，于4 ℃預冷的生理鹽水漂洗除去血液后，用濾紙吸干多余水分，稱取約50 mg 脾組織加入到1 mL TRIZOL 總RNA 提取試劑中，置-80 ℃冰箱保存。

2.4 脾細胞ERα、ERβ 和AR mRNA 表達水平的檢測

2.4.1 小鼠脾細胞總RNA 的抽提

將已加有TRIZOL 的脾組織充分勻漿，然后倒入1.5 mL 無菌無RNA 酶的離心管中，12000 rpm，4℃，離心10 min，吸取上清于另一干凈離心管中，棄沉淀;加入200 μL 氯仿，劇烈震蕩1 min，室溫靜置15 min，12000 rpm，4 ℃，離心10 min，用微量加樣器取上清液，轉移至另一個無菌無RNA 酶的1.5 mL離心管內;每管加入500 μL 異丙醇，混勻，12000 rpm，4 ℃，離心10 min，棄上清液;加入75% 乙醇(DEPC 水配制)1 mL，輕輕轉動洗滌離心管，12000 rpm，4 ℃，離心10 min，盡量棄上清;室溫晾干5 min;加入30 μL DEPC 水溶解沉淀，充分混勻，低速簡短離心使沉淀沉降;于-20 ℃保存。

2.4.2 cDNA 合成(逆轉錄)

反應總體積(20 μL):先取2 μL 模板RNA、2 μL Oligo(dT)15(10μM)引物、2 μL dNTP(2.5 mM)、8.5 μL ddH2O，72 ℃反應5 min 后迅速置于冰上放置2 min，然后逐一加入以下成分:4 μL 5 ×逆轉錄緩沖液、0.5 μL RNA 酶抑制劑(2 U)、1 μL M-MLV(200 U)。42 ℃反應50 min，95 ℃反應5 min 滅活反轉錄酶。逆轉錄產物(cDNA)于-20 ℃保存。

2.4.3 引物的設計與合成

小鼠ERα 基因上游引物序列:5'-CGCCTTCTACAGGTCTAAT-3'，

下游引物序列:5'-GGTTCTTGTCAATGGTGC-3';

小鼠ERβ 基因上游引物序列:5'-CTTGGTCACGTACCCCTTAC-3'，

下游引物序列:5'-GTATCGCGTCACTTTCCTTT-3';

小鼠AR 基因上游引物序列:5'-CCATCCAAGACCTATCGAGG-3'，

下游引物序列:5'-TGAGTCATCCTGATCTGGAG-3';

小鼠內參GAPDH 上游引物序列:5'-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3'，

下游引物序列:5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。

引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ERα 擴增產物片段大小為257bp，ERβ 為245bp，AR為為369 bp，GAPDH 為530 bp。

2.4.4 PCR 擴增

PCR 反應體系(25 μL):模板cDNA 2 μL，2 ×Taq PCR MasterMix(內含0.1 U Taq Polymerase/μL，500 μM dNTP，20 mM Tris-HCL(pH 8.3)，100 mM KCl，3 mM MgCl2)，上、下游引物(10 μM)各0.5 μL，加ddH2O 至總體積25 μL。反應條件:94 ℃，5 min;94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，共35個循環;最后72 ℃，10 min。PCR 產物于-20 ℃保存。取10 μL PCR 產物加樣，進行2%瓊脂糖凝膠電泳(用2000 bp PCR marker 作為分子大小參照物，100 V 穩壓電泳40 min)，紫外燈下觀察結果。經凝膠分析系統Quantity One 掃描后，以GAPDH mRNA 的RTPCR 產物作為內參照，測定RT-PCR 產物進行Adj.Vol.值(即為減去背景色后的條帶光強度值)，進行目的基因擴增片段與對照基因擴增片段Adj.Vol.值的比較［7］。以目的基因的cDNA 與GAPDH 的cDNA 灰度掃描值的比值代表其最終受體的mRNA表達水平。

2.5 統計分析

所有測定結果用均數標準差(s)表示。兩組間同一時點各對應指標的比較采用SPSS13.0 軟件進行t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 大蒜素對雌性小鼠脾細胞ERα、ERβ mRNA表達水平的影響

如圖1、2 結果顯示，與同一時點對照組相比，灌服14 d 和21 d 時，雌性小鼠脾細胞ERα mRNA 表達水平明顯增強，差異有統計學意義(P＜0.05);灌服14 d 時，雌性小鼠脾細胞ERβ mRNA 表達水平明顯明顯增強，差異有統計學意義(P＜0.05);灌服28 d 時，實驗組小鼠脾細胞ERα、ERβ mRNA 表達水平變化不明顯，差異無統計學意義(P ＞0.05);隨灌服時間的延長，ERα mRNA 水平有上升趨勢。各雌性小鼠脾細胞ERα、ERβ mRNA 與GAPDH mRNA 的RT-PCR 產物電泳圖見圖3～6。

圖1 雌性小鼠脾細胞ERα mRNA 表達水平Fig.1 ERα mRNA expression level in the spleen cells of female mouse

圖2 雌性小鼠脾細胞ERβ mRNA 表達水平Fig.2 ERβ mRNA expression level in the spleen cells of female mouse

圖3 14 d 雌性對照組和實驗組小鼠ERα、ERβ、GAPDH mRNA 的RT-PCR 產物電泳圖Fig.3 Electropherograms of RT-PCR products of ERα，ERβ，GAPDH mRNA in 14 d female control and experimental groups

圖4 21 d 雌性對照組和實驗組小鼠ERα、ERβ、GAPDH mRNA 的RT-PCR 產物電泳圖Fig.4 Electropherograms of RT-PCR products of ERα，ERβ，GAPDH mRNA in 21 d female control and experimental groups

圖5 28 d 雌性對照組和實驗組小鼠ERα、ERβ、GAPDH mRNA 的RT-PCR 產物電泳圖Fig.5 Electropherograms of RT-PCR products of ERα，ERβ，GAPDH mRNA in 28 d female control and experimental groups

3.2 大蒜素對雄性小鼠脾細胞AR mRNA 表達水平的影響:

如圖6 顯示，與同一時點對照組相比，灌服大蒜素14、21 和28 d 時，實驗組小鼠脾細胞AR mRNA表達水平明顯增強，差異有統計學意義(P＜0.05)。隨灌服時間的延長，小鼠脾細胞AR mRNA 表達水平有下降趨勢。各雄性小鼠脾細胞AR mRNA 與GAPDH mRNA 的RT-PCR 產物電泳圖見圖7～9。

4 討論

雌激素、雄激素屬于類固醇激素，廣泛存在于人體各個組織器官，在發育和維持身體正常機能方面發揮著重要作用。雌激素只有與雌激素受體結合(雄激素只有與雄激素受體結合)才能發揮作用，雌激素受體可分為經典受體(主要包括ERα 和ERβ)和膜受體(membrane ER，mER)。雄激素受體也可分為經典受體(AR)和膜受體(membrane AR，mAR)。經典的ER、AR 屬于核受體超家族，該家族成員在結構和功能上具有一定的相似性。

圖6 雄性小鼠脾細胞AR mRNA 表達水平Fig.6 AR mRNA expression level in the spleen cells of male mouse

圖7 14 d 雄性對照組和實驗組AR，GAPDH mRNA 的RT-PCR 產物電泳圖Fig.7 Electropherograms of RT-PCR products of AR and GAPDH mRNA in 14 days male control and experimental groups

圖8 21 d 雄性對照組和實驗組AR、GAPDH mRNA 的RT-PCR 產物電泳圖Fig.8 Electropherograms of RT-PCR products of AR and GAPDH mRNA in 21 days male control and experimental groups

圖9 28d 雄性對照組和實驗組AR、GAPDH mRNA 的RT-PCR 產物電泳圖Fig.9 Electropherograms of RT-PCR products of AR and GAPDH mRNA in 28 days male control and experimental groups

近年的研究發現，ERα、ERβ 和AR 廣泛存在于機體多處免疫組織中，如骨髓組織、胸腺組織，非胸腺淋巴樣組織、內分泌系統和中樞神經系統以及具有重要調節功能的下丘腦腹側核，但其表達量在不同免疫細胞甚至在細胞的不同分化階段均有所不同。越來越多的證據表明，雌激素和雄激素參與免疫系統的調節，在機體免疫功能和免疫介導性疾病中起重要作用。例如，免疫反應的性別差異、去勢后免疫應答的改變、免疫器官和細胞上存在性激素受體以及自身免疫性疾病發病的性別差異等。國內外研究發現，在小鼠脾細胞和人類T 淋巴細胞等多種免疫細胞上均有ERα、ERβ 和AR 的表達，且國外文獻還報道在創傷出血、自身免疫性疾病(如紅斑狼瘡)的T 淋巴細胞上ERα 和ERβ 的表達與T 細胞功能有關。研究發現更年期綜合癥患者外周血白細胞ER 含量明顯降低，使機體免疫力低下，而血管中ER 數目減少是絕經前女性冠心病易患因素之一。這些都表明ER、AR 與免疫系統存在緊密聯系，但是雌激素、雄激素作用于免疫系統哪些基因及其作用方式、與之相互作用的組織細胞特異性因子、下游調控的目的基因等問題還有待進一步研究。研究雄激素受體、雌激素受體與免疫系統的關系將有助于了解免疫系統的發育機制、免疫老化機制及自身免疫性疾病的發生機制，并對雌、雄激素在免疫調節方面的應用前景提供一定科研基礎。

本實驗通過給小鼠灌服大蒜素后，用逆轉入聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測小鼠脾細胞上ERα、ERβ 和AR mRNA 的表達水平。實驗發現，小鼠脾細胞上有ERα、ERβ 和AR 的表達，這與Benten［8］和Piesta［9］的研究結果一致。實驗結果顯示，大蒜素可以提高小鼠脾細胞上ERα、ERβ 和AR mRNA 的表達水平。提高脾細胞上ER、AR mRNA的表達水平，可以增強E-ER、A-AR 生物學效應，提高雌激素、雄激素對免疫系統的調節作用。目前關于大蒜素對雌激素、雄激素受體影響的研究較少，Stan［10］研究發現，大蒜素可以降低小鼠前列腺癌細胞上AR 的表達水平，這與本實驗結論不一致，推測可能是由于在本實驗中采用的是脾細胞，以及大蒜素是作用在正常小鼠體內，而不是病理狀態等因素造成。本實驗首次研究大蒜素對正常小鼠脾細胞ERα、ERβ 和AR mRNA 表達水平的調節作用，提示大蒜素可以通過內分泌系統對免疫系統進行調節。

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