響應面法優化柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量

王 蘭，顧 欣，趙 麟，龔 頻

陜西科技大學生命科學與工程學院，西安 710021

柿葉為柿科植物柿的新鮮或干燥葉，主要生物活性成分是柿葉中的總黃酮，大量實驗表明其具有明顯的抗氧化、抗衰老、增強機體免疫力、抗潰瘍、軟化血管、降血糖和降血脂等醫療保健作用［1，2］。響應面分析法(Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的試驗設計，采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析以尋求最佳工藝參數，解決多變量的一種統計方法。

目前，國內研究主要集中于柿葉總黃酮的提取純化方面，而對于柿葉總黃酮的新劑型還研究甚少。例如董江濤等［3］采用響應曲面法優化微波輔助提取柿葉中總黃酮的工藝，劉登勇等［4］利用響應面法優化柿葉總黃酮的超聲波輔助提取條件，蔣橙華等則用微波-超聲協同輔助提取柿葉中的總黃酮，并且應用響應面法對影響提取率的各因素進行分析擬合以優化工藝參數，李燕等［5］應用AB-8 型大孔樹脂分離純化柿葉總黃酮。在劑型研究方面，周文亮研制了注射用柿葉總黃酮粉針并考察其安全性，陳惠杰等制備了柿葉總黃酮醇質體，至今還尚未見柿葉總黃酮緩釋微丸的相關報道。

為了克服傳統劑型給藥次數較多和血藥濃度波動較大的不足，筆者擬制備柿葉總黃酮緩釋微丸;本文將以單因素試驗為基礎，以緩釋微丸的載藥量為響應值，采用響應面法分析法優化柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量。

1 材料與方法

1.1 材料

柿葉總黃酮(自制，黃酮的含量為55%～60%)，海藻酸鈉(西安中信精細化工有限公司)，氯化鈣(天津市大陸化學試劑廠)，殼聚糖(上海三愛思試劑有限公司)，乙酸(上海建信化工有限公司試劑廠)，氫氧化鈉(西安化學試劑廠)，無水乙醇(西安化學試劑廠)，亞硝酸鈉(北京化學試劑廠);硝酸鋁(上海新中化學廠);氯化鈣(天津市大陸化學試劑廠)。

1.2 主要儀器

HH-S4 型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司);BS224S 型電子天平(北京利多斯儀器系統有限公司);SP-752(PC)型紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);真空冷凍干燥機(常州品正干燥設備有限公司);78-1 型磁力攪拌器(國華電器有限公司);TGL-16M 高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 柿葉總黃酮緩釋微丸的制備

首先配制海藻酸鈉溶液，然后加入柿葉中總黃酮的提取物，使其完全溶解于海藻酸鈉溶液中。再分別配制氯化鈣溶液和殼聚糖的乙酸液，將上述的氯化鈣溶液緩慢加入殼聚糖乙酸液中，邊加邊攪拌直至混合均勻。最后將海藻酸鈉-柿葉總黃酮復合液滴入。在磁力攪拌器中加熱攪拌反應，待反應完全后，收集微丸，洗滌后干燥。

1.3.2 載藥量的測定

稱取適量的柿葉總黃酮緩釋微丸，在研缽中研細，置于70%乙醇溶液中浸泡過夜，再將溶液pH 調至6.8 左右，在磁力攪拌器作用下攪拌3 h，使藥物充分溶出，然后以3000 rpm 的轉速離心10 min 取上清液于510 nm 處測定吸光度［6］。最后按照以下公式計算出載藥量。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 海藻酸鈉濃度的選擇

固定殼聚糖濃度為2%，氯化鈣濃度為3%，投藥量為20%，攪拌轉速為500 rpm，反應溫度為40℃，攪拌時間為30 min，選擇海藻酸鈉濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，考察海藻酸鈉濃度對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.2 殼聚糖濃度的選擇

固定海藻酸鈉濃度為2.5%，氯化鈣濃度為3%，投藥量為20%，攪拌轉速為500 rpm，反應溫度為40 ℃，攪拌時間為30 min，選擇殼聚糖濃度依次為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，考察殼聚糖濃度對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.3 氯化鈣濃度的選擇

固定海藻酸鈉濃度為2.5%，殼聚糖濃度為2%，投藥量為20%攪拌轉速為500 rpm，反應溫度為40 ℃，攪拌時間為30 min，選擇氯化鈣濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，考察氯化鈣濃度對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.4 投藥量的選擇

本文以柿葉中總黃酮的提取物為主藥，固定海藻酸鈉濃度為2.5%，殼聚糖濃度為2%，氯化鈣濃度為3%，攪拌轉速為500 rpm，反應溫度為40 ℃，攪拌時間為30 min，選擇投藥量依次為10%、20%、30%、40%、50%，考察投藥量對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.5 攪拌轉速的選擇

固定海藻酸鈉濃度為2.5%，殼聚糖濃度為2%，氯化鈣濃度為3%，投藥量為20%，反應溫度為40 ℃，攪拌時間為30 min，選擇磁力攪拌的轉速分別為100、300、500、700、900 rpm，考察攪拌轉速對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.6 反應溫度的選擇

固定海藻酸鈉濃度為2.5%，殼聚糖濃度為2%，氯化鈣濃度為3%，投藥量為20%，攪拌速度為500 rpm，攪拌時間為30 min，選擇反應溫度依次為30、40、50、60、70 ℃，考察反應溫度對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.7 反應時間的選擇

固定海藻酸鈉濃度為2.5%，殼聚糖濃度為2%，氯化鈣濃度為3%，投藥量為20%，攪拌速度為500 rpm，反應溫度為40 ℃，選擇反應時間分別為15、30、45、60、75 min，考察反應時間對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.4 響應面優化載藥量［7，8］

根據Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，在確定其余因素的情況下，最終選取海藻酸鈉濃度(A)、殼聚糖濃度(B)、投藥量(C)和反應溫度(D)這4個因素，每個因素3個水平，應用Design expert 7.1.6 軟件設計4 因素3 水平的響應面試驗，對柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量進行優化。因素與水平設計見表1 所示。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Levels and code of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 海藻酸鈉濃度對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

由圖1A 可知，柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量隨著海藻酸鈉濃度的增大而增高，當海藻酸鈉濃度為2.5%時達到最大值，之后載藥量下降。因此，海藻酸鈉濃度以2.5%為宜。

2.1.2 殼聚糖濃度對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

由圖1B 所示，柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量隨著殼聚糖濃度的增大而增高，當殼聚糖濃度為2%時達到最大值，之后載藥量下降。考慮到載藥量是望大的，因此，殼聚糖濃度以2%為宜。

2.1.3 氯化鈣濃度對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

區別于海藻酸鈉濃度和殼聚糖濃度對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響，氯化鈣濃度對載藥量影響較小。由圖1C 所示，當氯化鈣濃度為3%時載藥量達到最大，隨后略呈下降趨勢。這可能是因為殼聚糖和氯化鈣形成瞬時凝聚珠并不是影響緩釋微丸載藥量的主要因素，綜合上述分析氯化鈣濃度以3%為宜。

2.1.4 投藥量對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

由圖1D 可知，柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量隨著投藥量的增大而增高，當投藥量為40%時達到最大值，之后載藥量下降。考慮到載藥量是望大的，因此，投藥量以40%為宜。

2.1.5 攪拌轉速對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

整體而言，攪拌轉速對載藥量影響較小。由圖1E 可知，當攪拌轉速為500 rpm 時載藥量達到最大，隨后呈下降趨勢。因此攪拌轉速應以500 rpm為宜。

2.1.6 反應溫度對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

由圖1F 可知，柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量隨著反應溫度的升高而增高，當反應溫度為50 ℃時達到最大值，之后載藥量下降。考慮到載藥量是望大的，因此，反應溫度以50 ℃為宜。

2.1.7 反應時間對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

整體而言，反應時間對載藥量影響較小。由圖1G 可知，當反應時間為45 min 時載藥量達到最大，隨后呈下降趨勢。分析可能是反應時間的延長不利于緩釋微丸中柿葉總黃酮的溶出。綜合上述分析反應時間以45 min 為宜。

2.2 響應面試驗結果

根據上述單因素試驗的結果，最終選取對響應值Y(載藥量)有顯著影響的4個因素，分別為海藻酸鈉濃度(A)、殼聚糖濃度(B)、投藥量(C)和反應溫度(D)，每個因素選取3個水平，應用Design expert 7.1.6 軟件設計4 因素3 水平的響應面試驗，對柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量進行優化。試驗結果見表2 所示。

圖1 海藻酸鈉濃度(A)、殼聚糖濃度(B)、氯化鈣濃度(C)、投藥量(D)、攪拌轉速(E)、反應溫度(F)和反應時間(G)對載藥量的影響Fig.1 Effects of concentration of sodium alginate (A)，concentration of chitosan (B)，concentration of calcium chloride (C)，quantity of reagent (D)，agitation speed (E)，reaction temperature (F)and reaction time (G)on drug loading rate

利用Design expert 7.1.6 軟件對表2 進行多元線性回歸擬合，得到柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量(Y)對海藻酸鈉濃度(A)、殼聚糖濃度(B)、投藥量(C)和反應溫度(D)的二次多項回歸方程為:Y=21.85 +0.97A +0.64B-0.95C +1.11D +1.2AB-0.28AC+1.3AD+0.2BC-0.73BD+1.16CD-1.38A2-3.58B2-1.15C2-5.5D2。

經方差分析可知，模型P 值＜0.0001 為極顯著，說明此模型模擬可靠;另外模型相關系數R2=0.9658，說明響應值Y(載藥量)的變化有96.58%來源于所選因素;同時信噪比為17.943，說明該模型有很強的信號。綜上所述，該模型模擬度高、方法可靠。

表2 響應面試驗結果Table 2 Box-Behnken design matrix and the experimental results

另外海藻酸鈉濃度(A)、投藥量(C)、反應溫度(D)、海藻酸鈉平方項(A2)、殼聚糖濃度平方項(B2)、投藥量平方項(C2)和反應溫度平方項(D2)對載藥量(Y)的影響極其顯著。

圖2 A-B(a)、A-C(b)、A-D(c)、B-C(d)、B-D(e)和C-D(f)對載藥量影響的等高線(C=0)與響應面圖Fig.2 Responsive surface plots and contour plots of A-B (a)，A-C (b)，A-D (c)，B-C (d)，B-D (e)and C-D (f)to drug loading rate (C=0)

影響柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的因素按影響大小依次為:反應溫度(D)＞海藻酸鈉濃度(A)＞投藥量(C)＞殼聚糖濃度(B)，其交互作用的響應面分析結果依次見圖2 所示。

由2 a-f 可知，海藻酸鈉濃度和殼聚糖濃度的交互作用(記為A-B)、海藻酸鈉濃度和反應溫度的交互作用(A-D)以及投藥量和反應溫度的交互作用(C-D)對柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響顯著。表現在響應面與等高線上即為響應面曲面比較陡，并且等高線呈橢圓狀。

2.3 驗證性試驗

對回歸模型進行分析計算，最終得出當海藻酸鈉濃度為2.75%、殼聚糖濃度為2.08%、投藥量為35.94%、反應溫度為51 ℃時載藥量是22.41%。結果與預測值相差不大，說明運用響應面法優化柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量是可行的。

3 結論

本文運用響應面法優化柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量。以單因素試驗結果為基礎，結合Box-Behnken 中心組合設計法和響應面分析法依次考察海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、投藥量和反應溫度及其交互作用對載藥量的影響，并且對回歸模型進行驗證確定了當海藻酸鈉濃度為2.75%、殼聚糖濃度為2.08%、投藥量為35.94%、反應溫度為51 ℃時載藥量是22.41%。另外關于柿葉總黃酮緩釋微丸體外釋放度的研究可見另文報道［9］。

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