鱧腸不同部位抗骨質疏松活性及化學成分比較研究

黃運喜，易 駿，吳建國，鄭淑霞，吳錦忠，吳巖斌*

1福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福州 350122;2 福建教育學院理科部，福州 350001

墨早蓮原名鱧腸，《本草圖經》稱為旱蓮草，又稱為金陵草、旱蓮子等［1］。2010 年版《中國藥典》記載中藥墨旱蓮為鱧腸Eclipta prostrata L.的干燥地上部分，具有滋補肝腎，涼血止血的功效，用于肝腎陰虛，牙齒松動，須發早白，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，陰虛血熱吐血、衄血、尿血、血痢、外傷出血［2］;1999 年出版的《中華本草》記載墨旱蓮來源為鱧腸屬植物鱧腸Eclipta prostrata(L.)L.［verbesina prostrata L.;E.Alba(L.)Hassk.］的全草［3］。現代化學和藥理研究表明，墨旱蓮主要黃酮類、噻吩類和香豆草醚類等化學成分，具有保肝、止血、抗炎、免疫調節、抗蛇毒、抗菌、抗氧化和抗骨質疏松等生物活性［4-8］。

前人研究墨旱蓮所選用材料為鱧腸全草而非干燥地上部分(墨旱蓮)［9，10］，且在市場流通中的墨旱蓮藥材，常混入鱧腸的根，而2010 年版《中國藥典》記載為墨旱蓮為鱧腸干燥地上部位。因為對鱧腸全草或地上部分(墨旱蓮)入藥存在爭議，因此比較鱧腸不同部位的生物活性及化學成分是否有差異來評價鱧腸根可否與地上部分(墨旱蓮)同時入藥，對指導中醫臨床用藥具有重要的意義。本實驗以成骨細胞增殖和分化以及墨旱蓮中主要化學成分皂苷和黃酮的含量為評價指標，研究鱧腸不同部位抗骨質疏松作用和化學成分的差異，為墨旱蓮在中醫臨床用藥及其資源利用提供依據。

1 材料和儀器

1.1 材料

鱧腸E.prostrata 采于福建省莆田市，由福建中醫藥大學藥學院黃澤豪副教授鑒定。

大鼠骨肉瘤(UMR106)細胞由上海第二軍醫大學生藥教研室贈送。DMEM 高糖培養液，胎牛血清，胰蛋白酶(美國Hyclone 公司)，青霉素-鏈霉素雙抗試劑(北京鼎國昌盛生物技術有限公司);MTT干粉(美國Sigma 公司);其余所用藥品和試劑均為分析純。

1.2 主要儀器和試劑

RE-2000 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);KQ-300DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-1800 紫外可見分光光度計(日本島津公司);DLSB-5/20 低溫冷卻循環泵(鄭州長城科工貿有限公司);YXQ-LS-70A 立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);移液器(德國Eppendorf);Anke TDL-50B 離心機(上海安亭科學儀器廠);SW-CJ-1FDA 超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);BCD-518WS A 冰箱(海爾);5417R 高速冷凍離心機(德國Eppendorf);HF212UV CO2 培養箱(Heal Force);TS100 倒置生物顯微鏡(Nikon);ELX800 酶標儀(biotek);DK-420 型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司);AR233CN 電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。

2 方法

2.1 不同部位提取物的制備

分別稱取鱧腸根，莖，葉按料液比為1 ∶15 用80%乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并濾液得提取液。

2.2 細胞培養

UMR106 細胞培養于含有10%新生胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 高糖培養液中，置37 ℃含有5% CO2的細胞培養箱中培養。當細胞生長達到對數生長期時，用0.05%含EDTA 胰酶消化傳代或接種。

2.3 UMR106 細胞的增殖實驗

將UMR106 細胞用含10% 新生胎牛血清的DMEM 高糖培養液配制成密度為5 ×104/mL 的細胞懸液，以100 μL 每孔的體積接種于96 孔培養板中，培養24 h 后，根、莖、葉三個部位提取物分別以50、25、12.5 μg/mL 三個濃度給藥，每個濃度5個復孔，繼續放入培養箱培養48 h，取出培養板，各孔加入100 μL 四氮唑藍(MTT，用PBS 液配制1 mg/mL的MTT 液)，放入培養箱中孵育4 h，取出培養板，在倒置相差顯微鏡下可見細胞內有條狀黑色沉淀，棄去上清液，每孔加入DMSO(二甲基亞砜)100 μL，DMSO 的顏色變成紫色，把96 孔培養板放于酶標儀上震蕩10 min 后使沉淀完全溶解于DMSO，于490 nm 處檢測各孔A 值。

2.4 UMR106 細胞的ALP 活性實驗

將UMR106 細胞用含10% 新生胎牛血清的DMEM 高糖培養液配成密度為5 ×104/mL 的細胞懸液。以100 μL 每孔的體積接種于96% 培養板中，培養24 h 后，根、莖、葉三個部位提取物分別以100、50、25 μg/mL 三個濃度給藥，每個濃度5個復孔，繼續放入培養箱培養，以后每3 天更換一次藥。培養至第8 d 測定。棄去培養液，PBS 沖洗2～3次，加50 mmol/L 的二乙醇胺100 μL，2.5 mmol/L的對硝基苯酚磷酸二鈉50 μL，37 ℃反應30 min，最后用0.3 mol/L 的氫氧化鈉100 μL 終止反應，于405 nm 處測A 值［8］。

2.5 皂苷及黃酮含量測定

2.5.1 標準品溶液的制備

精密稱取5.1 mg 旱蓮苷A 標準品，加甲醇定容至50 mL，配成0.102 mg/mL 溶液，作為皂苷對照品溶液。

精密稱木犀草素對照品20.1 mg，置于100 mL容量瓶中，加入60%乙醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃酮對照品溶液(即0.201 mg/mL)。

2.5.2 皂苷標準曲線繪制

精密吸取旱蓮苷A 對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL 分別置具塞試管中，置水浴上揮去溶劑，加入新配制的1%香草醛-高氯酸溶液0.5 mL，60 ℃水浴中加熱15 min，立即冰水冷卻2 min，加77%硫酸溶液5.0 mL，搖勻，于550 nm 處測定吸光度。以含量(C)與吸光度(A)進行直線回歸，得回歸方程A=0.0336C +0.0007，R2=0.9994(圖1)，線性關系良好。

圖1 旱蓮苷A 標準曲線Fig.1 The standard curve of ecliptasaponin A

2.5.3 黃酮標準曲線繪制

分別吸取標準應用液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 mL 于25 mL 容量瓶中，用60%乙醇定容至10 mL，先加5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min;再加10%的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min;再加4%的氫氧化鈉溶液10 mL，用60%甲醇稀釋至刻度，放置10 min，在波長512 nm 處測定吸光度［11］，以含量(C)與吸光度(A)進行直線回歸，得回歸方程A=0.0221C-0.007，R2=0.9992(圖2)，線性關系良好。

圖2 木犀草素標準標曲線Fig.2 The standard curve of luteolin

2.5.4 樣品的皂苷及黃酮含量測定

精密吸取供試品溶液0.1 mL 置具塞試管中，水浴上揮去溶劑，按2.5.2 項下操作，相應試劑隨行空白對照，于550 nm 處測定吸光度，計算皂苷的含量。

精密吸取供試品溶液1.0 mL 于25 mL 容量瓶中，按2.5.3 項下操作，在波長512 nm 處測定吸光度，計算黃酮含量。

2.6 統計學處理

采用SPSS 18.0 軟件進行統計分析，組間采用單因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 鱧腸不同部位對UMR106 細胞增殖的影響

鱧腸根、葉的80%乙醇提取物對UMR106 細胞均具有增殖作用，濃度為50 μg/mL 時作用最強，增殖率分別為7.7%(P＜0.01)，16.9%(P＜0.001)(圖3)，其中葉的提取物增殖對UMR106 細胞的增殖能力最強，且P＜0.001 具有顯著性差異。

圖3 鱧腸不同部位提取物對UMR106 細胞增殖的影響Fig.3 Effect of the extracts from different parts of E.prostrata on UMR-106 cell proliferation.

3.2 鱧腸不同部位對UMR106 細胞ALP 活性的影響

鱧腸根、莖、葉的80%乙醇提取物對UMR106細胞的ALP 活性均具有促進作用，濃度為100 μg/mL 時作用最強，分別促進18.9%(P＜0.001)，20.1%(P＜0.01)，17.0%(P＜0.001)(圖4)。

4 鱧腸不同部位提取物對UMR106 細胞ALP 活性的影響Fig.4 Effect of the extracts from different parts of E.prostrata on UMR-106 cell ALP activity

3.3 鱧腸不同部位總皂苷和總黃酮含量

鱧腸根，莖，葉中皂苷含量分別為3.6%，4.0%，2.2%;黃酮含量分別為1.4%，1.4%，3.4%(圖5)。其中鱧腸莖中的皂苷含量最高，而黃酮含量最低;葉中的皂苷含量最低，而黃酮含量最高，根的皂苷、黃酮含量居中。

圖5 鱧腸不同部位總皂苷和總黃酮含量Fig.5 The contents of total saponins and total flavonoids from different parts of E.Prostrata

4 討論

成骨細胞在骨形成過程中主要經歷成骨細胞增殖、細胞外基質成熟、礦化和成骨細胞凋亡四個階段［12］。其中，成骨細胞增殖期成骨細胞數量增加，形成多層細胞，并合成、分泌I 型膠原以便最終可以礦化形成骨結節;在增殖晚期，成骨細胞增殖速度減慢，由增殖期進入分化期;在分化早期主要是ALP表達，ALP 是成骨細胞所分泌的一種同源二聚體糖蛋白，其表達的強度是識別和評價成骨細胞分化程度的早期特異性標志，而且表達隨著細胞分化的發展而增強。因此，ALP 被認為是細胞外基質早期和中期分化的標志［13］。骨代謝中，骨生成與成骨細胞的增殖與ALP 活性相關［14］。

墨旱蓮是滋補肝腎的常用中藥，含有多種黃酮和皂苷類成分，其所含的黃酮類成分木犀草素、芹菜素、槲皮素、Dismetin、3'-hydroxybiochanin A 和3'-Omethylorobol 等［7，15，16］均具有一定的抗骨質疏松作用。研究結果顯示鱧腸不同部位乙醇提取物對UMR106 成骨細胞增殖和ALP 活性有不同程度的促進作用，其中鱧腸根對成骨細胞增殖和ALP 活性均有顯著的促進作用，對ALP 活性的促進作用與莖和葉的差異并不大。化學成分分析結果顯示，鱧腸不同部位總皂苷和總黃酮的含量差異較大，其中根與莖的總皂苷和總黃酮含量差異并不大。

墨旱蓮為鱧腸地上干燥部分，實驗表明，鱧腸的根與鱧腸地上部分有相似的生物活性，這可能也是文獻記載墨旱蓮為醴腸全草入藥的原因［3］。因此，我們認為，市場流通中的墨旱蓮藥材中混有少量的醴腸根并不會影響到墨旱蓮藥材的整體質量。另外，雖然已有許多墨旱蓮皂苷和黃酮化學成分的研究［6，10，17］，但至今其質量標準中仍未有該項目的檢測，因此建立墨旱蓮總皂苷和總黃酮的測定方法為其藥材質量標準的研究提供依據。

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