人參皂苷Rb1對增生性瘢痕影響的研究

李昕珊，岳毅剛*，張克勤，孫瑞軍，陳乃玲

1桂林醫學院附屬醫院整形外科，桂林 541000;2 桂林市南溪山醫院整形外科，桂林 541000;3河北聯合大學，唐山 063000

瘢痕組織是人體創傷修復過程中的一種必然產物，防治增生性瘢痕的方法有很多如藥物、放射［3］、壓力和手術等方法。根據已知的增生性瘢痕的可能機制和發病原因［6］已形成了從抑制成纖維細胞增殖和膠原代謝的水平尋找治療和預防瘢痕增生的方法。

傳統中醫對瘢痕的治療累積了豐富的經驗，且有較顯著療效［13］。人參皂苷Rb1為人參中提取的單體成分，劉鶴松等［12］已對人參皂苷Rg3抑制增生性瘢痕的效果做了闡述，認為有效。對本研究選用更為經濟廉價的Rb1成分同樣以兔耳增生性瘢痕為研究對象，通過VG 特異性膠原染色，和免疫組織化學相關因子的檢測和原位雜交檢測膠原I mRNA，同樣認為人參皂苷Rb1有抑制增生性瘢痕發展的作用。

通過建立增生性瘢痕的動物模型對瘢痕的外部形態和顯微鏡下的微觀結構的觀察和測量等方式，對瘢痕的動態發展和應用藥物干預的發展變化做闡述。應用原位雜交方法檢測膠原I 型mRNA 的表達，從分子的角度進一步說明了人參皂苷Rb1有抑制增生性瘢痕進一步發展的可能。

1 材料與儀器

新西蘭大耳白兔15 只，雌雄不限，體重2.6～3.5 kg，單籠飼養，由河北聯合大學實驗室提供。人參皂苷Rb1純品(純度≥98%)，天津灝洋生物科技有限公司提供，用無菌注射用水配制成濃度分別為0.2、0.4、1.0 mg/mL;膠原I 型蛋白(bs-0578R)，Caspase 3 試劑盒(bs-0081R);兔二步法檢測試劑盒(PV-6001);DAB 及DAB 增強劑(ZLI-9034)購自北京中衫金橋生物技術有限公司;VG 染色試劑盒(珠海貝索生物技術有限公司);原位雜交膠原I 型mRNA 試劑盒(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司提供)，含公司設計的成品陽性探針和陰性探針。防脫片及無DNA 和RNA 酶處理的氨基酸載玻片(中國醫學科技院生物醫學工程研究所提供)，DEPC，光學顯微鏡，圖像分析軟件Motic 等由河北聯合大學基礎實驗室提供。

2 試驗方法

2.1 增生性瘢痕動物模型的建立

實驗兔子適應性喂養7 d 后，根據李薈元［1］等建立的增生性瘢痕動物模型法，嚴格無菌操作下，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉3.0 mL/kg。分別于兔耳腹側面中段的內、外、中部(避開可見血管)用直徑約為1.0 cm 的打孔器各形成一個圓形標記，每只耳朵2～3 處，間隔≥1.0 cm，建立兔耳增生性瘢痕模型。術中嚴格無菌操作切除圓形標記范圍內除包括軟骨膜在內的全層皮膚至軟骨膜表面，保留軟骨，壓迫止血，不予包扎。術后7 d 嚴格無菌操作下去除創面新生的肉芽組織和血痂，不包扎，任其愈合。

2.2 實驗分組、標本取材固定

每只兔子耳5 處創面分別為空白對照組(a):術后不進行任何處理;生理鹽水對照組(b):上皮化后(即26 d 后)在兔耳創面周圍皮下注射生理鹽水;治療組上皮化(約26 d)后兔耳創面周圍皮下注射不同濃度的人參皂苷Rb1(0.2 mg/mL，c)、(0.4 mg/mL，d)、(1.0 mg/mL，e)。每處創面注射劑量約為0.3 mL，每3 d 一次，共三次。大體觀察創面愈合和增生性瘢痕情況。

分別于術后第2、4、6 周切去瘢痕組織標本每次取4 只兔子，放于質量分數為4 的多聚甲醛固定液中固定，24～72 h 石蠟包埋，沿組織橫切面進行切片(從組織取材至切片凡是接觸組織的手術器械，固定液，切片刀片，盛放組織的玻璃瓶，塑料包埋盒，切片展片水等全部必須無酶處理，以免污染，操作人員數量盡量少，操作過程戴帽子口罩手套并少言少語，原位雜交用專用載玻片。)，進行HE 染色及VG染色，膠原Ⅰ型蛋白和Caspase 3，圖像分析系統測量計算HI，膠原纖維密度，原位雜交測膠原Ⅰ型mRNA 的表達。

2.3 肉眼和顯微鏡下觀察和測量

創面愈合情況:術后26 d，肉眼觀察各組增生性瘢痕的硬度，色澤，形態。

鏡下觀察:常規HE 染色，紅色為胞漿成分，藍紫色顯示細胞核。VG 染色:膠原纖維染成紅色，肌纖維、神經膠質、紅細胞染黃色，細胞核呈藍黑色或棕藍色。

瘢痕指數測量:應用Motic 軟件系統，HE 染色后鏡下觀察，低倍顯微鏡標尺測量瘢痕厚度，測量三次取平均值。計算增生性瘢痕指數HI(用來測量真皮層增生程度的指標)［2］。

HI=瘢痕高度(SH)/健康皮膚高度(DH)。

膠原含量測定:VG 染色，×200 倍光鏡下，每個切片隨機選取5個視野，利用圖像分析系統計算膠原面積［5］，結果取均數。

2.4 免疫組化(Collagen I，Caspase-3 蛋白的表達)

Collagen I:應用常規二步免疫組化法嚴格按試劑和說明書操作，以PBS 代替一抗為陰性對照，有棕黃色顆粒者為陽性細胞，在200 倍光鏡觀察下隨機取5個視野進行計數，結果取均數。

用免疫組化的方法進行含量的測定，石蠟切片經二甲苯脫蠟兩次每次5 min，酒精浸洗無水、95%各兩次，每次5 min，后放入0.5Triton 15 min，3 %H2O210 min，水化5 min，用Super PAP Pen 沿組織周圍畫圈，點上質量濃度為1 g/L 的消化酶37 ℃，20 min。放入PBSⅠ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，于濕盒中滴加一抗，4 ℃冰箱過夜(或37 ℃，1 h 30 min)，取出置常溫，PBS 沖洗3 次，5 min/次，滴加二抗，37 ℃孵育40 min，PBS 沖洗3 次，5 min/次，DAB 顯色，水沖＞30 min，蘇木素復染3 min，鹽酸酒精分化2 s，自來水沖洗＞30 min，95%、無水酒精各兩次，每次5 min，二甲苯兩次，15 min/次，中性樹膠封片，晾干。

Caspase-3:應用常規二步免疫組化法嚴格按按試劑和說明書操作，以PBS 代替一抗為陰性對照，棕黃色顆粒者為陽性細胞，在200 倍光鏡觀察下隨機取5個視野進行計數，結果取均數。

2.5 原位雜交測I 型膠原mRNA 的表達

探針濃度:8 μg/mL 雜交液。

Collagen 1 A 1 探針設計(試劑公司設計的成品探針):

NM_000088 5927 bp homo sapiens collagen，type Ⅰ，alpha 1 (COL1A1)，mRNA.

AY633663 524 bpOryctolaguscuniculus preproalpha-1 collagen type ⅠmRNA，

XM_001081230 5862 bpRattusnorvegicusprocollagen，type 1，alpha 1 (Col1a1)，mRNA.

NM _007742 4709 bpMusmusculusprocollagen，type Ⅰ，alpha 1 (Col1a1)，mRNA.

HRM1304-1277 TGTCCATCAGCACCAGGGTTTCCAGCAG

HRM1358-1325 AAGCCAGGAGCACCAGCAATACCAGGAGCACCAT

HRM3431-3402 TGTTCGCCTGTCTCACCCTTGTCACCACGG

R369-336 CGTGCTTCTTCTCCTTGGGGTTCTTGCTGATGTA

R481-456 TCGGTGGACATGAGGCGCAGGAACGT

5'-TCTTC TCCTT GGGGT TCTTG CTGAT GTA

5'-CGGT GGACA TGAGG CGCAG GAACG T

烤片后脫蠟，0.5%曲拉通洗滌，質量分數為3的過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，PBS 洗滌后復合消化，洗滌后滴加預雜交工作液，再次洗滌滴加小鼠抗地高辛孵育(在此之前所有的操作均應在無酶環境中進行，所有用品包括藥物和器材均做無酶處理)，洗滌后滴加高敏過氧化物酶鏈親和復合物孵育，洗滌后滴加DAB 及其增強劑顯色，復染蘇木素，脫水封片。

2.6 統計學處理

3 實驗結果

3.1 肉眼觀察

各組創面均愈合良好，未見感染不愈，各組愈合時間約為26 d，外觀粗略觀察各組間無顯著差別。瘢痕增生隆起突出于周圍正常皮膚表面，但未超出創傷范圍，可見a、b 組形成的增生性瘢痕最顯著，瘢痕呈圓形，范圍未能超出造模時打孔器的標記范圍，中央呈“小丘樣”或“乳頭樣”凸起，質硬;c～e 組與前兩組比較，瘢痕增生程度較輕，表面較平坦，質略軟，色淺(圖1)。

11月8日起，美國加州北部及南部爆發山火并迅速蔓延，大火范圍達近4.5萬公頃，山火造成31人死亡，此外還有228人失聯。此次山火已成為加州歷史上最具破壞性的一次火災，估計死亡人數將進一步上升。

圖1 動物模型制作結果Fig.1 Images of animal model of hypertrophic scar at different stages

3.2 組織學變化

常規HE 染色:正常組織表皮細胞層數少，細胞排列整齊，膠原排列整齊幾乎成平行狀態，間隙分明，條理性明顯，細胞成分少，少見血管組織。a、b組差別不大，表皮細胞層數明顯增多，細胞排列雜亂，體積變大，膠原增生明顯，膠原纖維排列雜亂扭曲難以看到整體形態，間隙不明顯，常見膠原結節出現和漩渦狀結構，細胞成分明顯增多，細胞體積變大，血管組織數量較正常組增多。c、d、e 組隨著藥物濃度的增加膠原排列越顯整齊數量減少，觀察到的細胞成分減少，并且可見到趨于水平排列的多層膠原纖維束，新生血管和膠原結節的數量也相應減少(圖2)。

圖2 各組瘢痕HE 染色結果Fig.2 Images of HE staining of hypertrophic scar

VG 染色:膠原纖維染成紅色，肌纖維、神經膠質、紅細胞染黃色，細胞核呈藍黑色或棕藍色。各組變化如HE 表現(如上)，見圖3。

圖3 各組VG 染色結果Fig.3 Images of VG staining of hypertrophic scar

瘢痕增生指數HI 結果見表1:a、b 組的差異無統計學意義(P ＞0.05)，c～e 組的HI 指數相比a、b組降低，有統計學意義(P＜0.05)，c、d 組間差異無統計學意義(P ＞0.05)，c、d 組比e 組的HI 指數高，有統計學意義(P＜0.05)，高濃度1.0 mg/mL 人參皂苷Rb1有效抑制瘢痕增生。

膠原纖維密度，含量測定，結果見表2:a、b 組之間膠原纖維密度無顯著性差異(P ＞0.05)，c、d、e 組的膠原密度相比a、b 組下降，有統計學意義(P＜0.05)，c、d 組間差異無統計學意義(P ＞0.05)，c、d組比e 組高，有統計學意義(P＜0.05)。

3.3 免疫組織化學結果

Collagen I 分布特征:主要分布在真皮的細胞間質，成纖維細胞、血管壁亦見少量的陽性信號。Ⅰ型膠原蛋白的陽性表現見棕黃色顆粒，略粗，密度高，排列不規則，可呈旋渦狀(如圖4)。a、b 組的差異無統計學意義(P ＞0.05)，c～e 組Collagen I 的陽性表達相比a、b 組降低，有統計學意義(P＜0.05)，c、d 組間差異無統計學意義(P ＞0.05)，e 組比c、d 組的Collagen I 陽性表達降低，有統計學意義(P＜0.05)。

圖4 CollagenⅠ組織化學Fig.4 Collagen Iimmunohistochemical of hypertrophic scar

Caspase-3:陽性表達為棕黃色顆粒信號，見局灶性分布或彌漫分布細胞和組織中，主要表達于表皮基底層細胞的胞漿內(如圖5)。a、b 組的差異無統計學意義(P ＞0.05)，c～e 組的Caspase-3 陽性表達相比a、b 組升高，有統計學意義(P＜0.05)，c、d 組間差異無統計學意義(P ＞0.05)，e 組比c、d 組的陽性表高，有統計學意義(P＜0.05)。

圖5 Caspase-3 組織化學Fig.5 Caspase-3 immunohistochemical of hypertrophic scar

圖6 原位雜交染色collagen I mRNAFig.6 collagen I mRNA staining of hypertrophic scar

3.4 原位雜交的染色觀察結果

陽性表達為棕黑色顆粒(使用DAB 增強顯色作用)，纖維結節處多見。圖像分析結果顯示Collagen I mRNA 的表達隨藥物濃度增高而減少，對照組a、b無差別，相比實驗組屬于高表達(如圖6)。

4 討論

瘢痕有正常瘢痕和病理性瘢痕兩大類，病理性瘢痕又分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，其形成是由于創傷愈合過程成纖維細胞合成膠原能力增強，導致細胞外基質(FCM)增多和過度沉積，膠原為其主要成分。增生性瘢痕(HS)是皮膚真皮損傷愈合后遺留的高出周圍正常皮膚、發紅、堅硬的病理結構，可以出現瘙癢、疼痛等不適癥狀，而且在不同形成階段有不同的臨床表現和發展趨勢，不僅嚴重影響外貌和功能，也會對患者心理造成影響。

表1 HI 測量統計結果(n=75，)Table 1 The measurement results of HI (n=75，)

表2 膠原含量測定統計結果，collagen I、Caspase-3 陽性細胞反應統計，原位雜交染色統計(用藥后第6 w)Table 2 The determination results ofcollagen content，collagenI，Caspase-3 positive cells reaction，in situ hybridization statistics(week 6)

增生性瘢痕的治療方法有:藥物治療、壓迫治療、按摩治療、放射治療、激光［3］、生物治療、基因及手術治療等。然而至今還沒有發現非常令人滿意的特別有效的防治策略。現有方法在療效上都存在有一定的局限性，新方法還在不斷探索中。

中藥治療瘢痕有悠久的歷史，對瘢痕的認識有著獨特的觀點，中醫學認為瘢痕形成主要由氣血壅滯、經絡痹阻、痰濕搏結所致，或相輔相成。治療上亦多采用活血化瘀、攻毒散結之品。只要方法有內治法、外治法和內外兼治。以往資料對人參皂苷單體的藥理作用，以及作用機制已經很深入，很多已進入分子、蛋白、基因組水平，人參皂苷單體抗細胞纖維化，促血管生成與抑制TGF-β1 的刺激膠原增生的作用均提示人參皂苷有效成分具有促進傷口愈合預防增生性瘢痕的產生的作用。Kimura Y［4］，將低濃度人參皂甙Rb1應用與燒傷創面的小鼠，發現人參皂甙Rb1有強大的促進創面愈合能力。亦有研究認為人參皂甙Rb1抑制ECM 分泌的作用［5］。趙自然［6］等認為人參皂苷Rg3能夠抑制病理性瘢痕的增生，但價格昂貴。至此對人參皂甙Rb1的研究主要在神經和心血管方面［7，8］，而在瘢痕的研究還屬少見。但李俊飛［9］認為Rb1能增加正常人成纖維細胞的增殖水平，所以對Rb1對增生性瘢痕的治療效果還要從用藥時機、濃度和方式等多方面進行深入探討。

現在常用于病理性瘢痕的研究途徑主要有①人體瘢痕組織體外培養成纖維細胞;②觀察記錄臨床病例和研究術后標本;③制作動物模型。

目前應用于建立增生性瘢痕動物模型的主要有新西蘭白兔、日本大耳白兔、裸鼠、杜洛克雌豬等。裸鼠模型引起免疫系統缺失可將增生性瘢痕組織移植至此，進行一系列的研究分析，但由于此種瘢痕并不是物種本身所產生，所以無法細致的觀測到增生性瘢痕的動態發展變化，同途徑①、②，雌性杜洛克豬由于其來源和成本問題難以普遍推廣。Morris［2］等首先在兔耳腹側的創面上發現真皮過度增生現象與人類增生性瘢痕樣改變相似。國內學者在兔耳腹側成功建立了增生性瘢痕動物實驗模型，并從多個側面驗證了兔耳增生塊與人類瘢痕的相似性。兔耳的增生性瘢痕因為是動物自身產生，研究者可對瘢痕的動態變化進行觀察，又介于來源廣泛成本問題等，成為目前研究的常用動物。

由檢測結果得知HI 和膠原密度隨藥物濃度的增加而下降，從外觀上明顯觀察到瘢痕增生的抑制作用。而c、d 組的組間差異不明顯，懷疑與應用的藥物濃度有關，還需以后的實驗中進一步的探討藥物濃度的選擇。

瘢痕組織中基質成分包括膠原纖維、結構性蛋白及蛋白多糖等，其中膠原纖維是瘢痕組織的主要成分，其中又以Ⅰ型膠原纖維居多，I 型膠原粗、僵硬，瘢痕質地硬，彈性差。膠原的合成與降解是一個復雜的動態過程，主要涉及蛋白質的翻譯、翻譯后的修飾、剪接，在這個過程中，多種生物活性酶如氧化酶、蛋白酶、膠原酶和金屬蛋白酶等參與其中［10］。正常情況下，膠原合成與分解呈動態平衡。當這種平衡被打破，導致成纖維、肌纖維母細胞合成膠原增多，分解減少，合成速度遠大于膠原分解，最終導致了膠原沉積，從而形成瘢痕組織。成纖維細胞是產生膠原的主要細胞，所以抑制成纖維細胞的增殖和調節膠原蛋白的合成可能是治療增生瘢痕的有效途徑。

增生性瘢痕以Ⅰ型膠原為主，所以Ⅰ型膠原量的變化可以直接顯示增生性瘢痕的增生狀態。如此實驗結果顯示隨人參皂苷藥物濃度的提高，免疫組化結果中Ⅰ型膠原的陽性表達越低，也就是說人參皂苷Rb1有抑制增生性瘢痕的趨勢。

Caspase-3 為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteine requiringaspartateprnteaseaspase)家族成員。Caspase 蛋白酶家族，是近年凋亡調控機制的研究熱點。已發現的十幾個家族成員，他們參與轉導凋亡信號或直接作為凋亡效應分子，促進細胞骨架降解和DNA 片斷化。許多影響細胞凋亡的基因，如p53、bcl-2、Fas、Rb 等細胞因子和藥物都能通過調節caspase 活化發揮作用。

Caspase-3 作為關鍵分子在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用。膠原的分解速度趕不上合成的速度以至于發生沉積，推測因為成纖維細胞的凋亡不足，過度的增殖分泌大量膠原蛋白，Caspase-3 正常以酶原的形式存在于胞核(漿)中，在凋亡的早期階段被激活后作用于其底物。有學者發現增生瘢痕中Caspase-3 表達降低［11］。本實驗結果顯示，對照組a、b 中Caspase-3 相比于用藥組c、d、e的表達明顯較弱，作者認為人參皂苷激發Caspase-3活性，促進誘導成纖維細胞的凋亡以達到治療增生性瘢痕的作用。

前膠原是膠原蛋白的前體和胞內形式。前膠原基因是由多個外顯子和內含子構成的斷裂基因，它的過度表達使膠原合成異常增加，易導致瘢痕的形成，抑制基因的表達將有助于減少膠原的合成從而防治瘢痕。增生性瘢痕組織的主要成分是Ⅰ型膠原，Ⅰ型前膠原在細胞內產生后分泌到胞外基質，通過內切肽酶等的作用，再通過聚合形成膠原纖維。故Ⅰ型前膠原的轉錄及合成水平可以代表細胞的膠原合成能力。如實驗結果顯示，a、b 組的表達最高無差異，c、d、e 組的陽性表達與人參皂苷濃度成反比。

本研究建立動物模型，對瘢痕用藥干預，通過外觀形態，組織切片染色，免疫組化方法研究膠原量和細胞凋亡的變化趨勢，并應用原位雜交的方法從基因的角度深入的印證人參皂苷對增生性瘢痕的治療效果，認為有效。中藥應用于增生性瘢痕期待有更升入全面的探索，從患者的安全性和依從性上考慮，傳統醫學在病理性瘢痕的治療的優勢上不可小覷。

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