富硒靈芝調控大鼠乙酰輔酶A 羧化酶α 表達治療非酒精性脂肪肝病的研究

武俊紫，賈亞敏，沈平瑞，胡躍高，全勝麟，李 燕*，李樹德

1昆明理工大學昆華醫學院，昆明 650504;2 云南省第一人民醫院干部保健科，昆明 650031;3太原理工大學現代科技學院，太原 030021;4 沈陽康硒生物工程研究所，沈陽 110015;5中國農業大學農學與生物技術學院，北京 100094;6 昆明醫科大學基礎醫學院，昆明 650504

硒(Selenium，Se)是人體必需的微量元素之一［1］，其在肝臟內是構成谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)的重要成分之一。人體內硒的主要來源為食物，但富硒食品相對較少。靈芝(Ganoderma)是藥食兩用菌，屬于珍貴的藥用真菌之一，具有養心安神、補氣益血、補肺平喘、滋補強壯、扶正固本等功效，同時靈芝對某些微量元素特別是硒具有高度的富集作用，可以將水中添加無機硒轉化為有機硒，利于人體攝入［2］。本實驗采用富硒靈芝治療非酒精性脂肪肝病(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)大鼠，現對治療前后大鼠SREBF1、ACCα 及其相關因子做統計分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

60 只雄性清潔級SD 大鼠［合格證號:SYXK(滇)2011-0004］，體重160～180 g，動物、基礎飼料以及飼養用墊料均由昆明醫科大學動物實驗部提供。

1.1.2 高脂溶液配制與灌胃量

97%豬油、2%膽固醇與1%膽酸鈉配置100%高脂溶液，大鼠灌胃時采用16 mm 灌胃針頭，大鼠灌胃量為每100 g 大鼠體重灌1 mL 高脂溶液，每天早上灌胃一次，另模型對照組和富硒靈芝治療組在造模全程內日常飲水均為10%的紅糖水。

1.1.3 藥品與試劑

富硒靈芝(含硒量為3.162 mg/kg)，由沈陽康硒生物工程研究所提供。膽固醇購自北京鼎國生物技術公司，膽酸鈉購自上海金穗生物公司，豬油和紅糖市場自購;血糖、GSH、MDA、SOD 試劑盒購自南京建成生物工程研究所;ALT、AKP、r-GT、胰島素以及AST 等相關ELISA 試劑盒購自Bio-Swamp 公司，LDH 試劑盒購自上海谷研實業有限公司，鼠抗兔多克隆抗體SERBF-1、ACCα 和ECL 發光試劑盒購自美國Santa Cruz 公司，相應二抗購于中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 非酒精性脂肪肝模型的建立及給藥方法

60 只SD 大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、富硒靈芝組，造模成功后富硒靈芝組每只大鼠每次給予富硒靈芝水5 mL(1 g 富硒靈芝+10 mL 水煮沸0.5 h，冷卻過夜浸泡)，每天灌胃二次，模型對照組給予相應生理鹽水灌胃參照，空白對照組則不加以任何干涉，分別與6 周和12 周處死大鼠各半，測定其相應指標。

1.2.2 標本的采集

用3%水合氯醛腹腔內注射麻醉，麻醉后無菌操作暴露腹腔，10 mL 注射器心臟迅速取血;血液離心，取上清液，-86 ℃保存;肝臟稱取100 mg 用于勻漿提取上清液，其余-86 ℃保存。

1.2.3 病理學檢查方法

取肝左葉，10%中性福爾馬林溶液固定，肝臟組織酒精脫水，石蠟包埋、切片，HE 染色，光鏡下觀察肝臟病理學改變，并采取不同視野，每個切片照四張像。

1.2.4 相關指標檢測方法

GSH 以及血糖的測定方法為酶法，MDA 測定方法為TBA 法，SOD 的測定方法為WST-1 法，LDH、ALT、AKP、r-GT、胰島素以及AST 測試方法為雙抗體夾心法。

1.2.5 RT-PCR 檢測SERBP-1、ACCαmRNA 的表達

取肝臟組織15 mg，用天根總RNA 提取試劑盒提取總RNA，定量后每組各取2 μg 逆轉錄cDNA，然后用逆轉的cDNA 2 μL 為模板，采用PCR Master-Mix 試劑進行PCR 反應擴增SERBP-1 和ACCα 目的片段。PCR 擴增反應條件如下:98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s、SERBP-1 為46.6 ℃退火(ACCα 為47.8 ℃退火)30 s、72 ℃延伸35 s，循環次數34 次;最后再延伸5 min。PCR 反應產物在含核酸染料(1 μL 核酸染料配比100 mL 瓊脂糖溶液)的1.6%瓊脂糖凝膠中電泳30 min，電壓110 V，電泳完成后用凝膠成像儀拍照采集圖像，Image J 軟件計算各條帶的熒光強度值，以β-actin 作為內參進行標準對照。每組實驗重復3 次。

SERBP-1 引物設計為:PrimerA:5' CGTTCGCCATAACCAAGTAGAG 3'，PrimerB:5' GGCGATGCTGTACACTGTTGA 3'，產物長度為126bps。ACCα 引物設計為:PrimerA:5' AGCGCTACCGTTCCTCTATCAA 3'，PrimerB:5' GCTGTAAGAAGCGGATGTAGTCG 3'，產物長度為118bps。β-actin 引物設計為:PrimerA:5'GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3'，PrimerB:5'ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG-3'，產物長度為123bps。

1.2.6 Western Blot 檢測SERBP-1、ACCα 蛋白的表達

取肝臟組織100 mg 用組織細胞裂解液制作勻漿，BCA 法測定蛋白質含量，取樣本SERBP-1 為100 μg(ACCα 為60 μg)進行SDS-PAGE 電泳，半干轉法將蛋白轉移至PVDF 膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h 后加入相應多克隆一抗，搖床劇烈搖半小時后4 ℃過夜，洗膜3 次，每次15 min，加入相應的HRP 標記的二抗孵育，洗滌后與ECL 發光試劑反應，曝光洗片，掃描圖像后用Image J 軟件計算各條帶的灰度值，以βactin 作為內參進行標準對照。每組實驗重復3 次。

1.3 統計學處理

所有的數據均用SPSS19.0 統計軟件進行處理分析。計量資料均以均數± 標準差()表示。多組間兩兩比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊時采用LSD 法，方差不齊時采用Tamhane's T2 法。檢驗水準=0.05。

2 實驗結果

2.1 大鼠肝臟HE 染色比較圖

HE 染色可明顯看出，模型對照6 周組出現不同程度的脂肪變性及空泡樣變，肝細胞極度腫脹呈圓形，體積較空白對照6 周組明顯增大;富硒靈芝6周組脂肪變性程度及細胞腫脹明顯減輕，炎性細胞浸潤及壞死灶較模型對照組明顯減少，空白對照6周組看不到任何脂滴及壞死特征;12 周組大鼠肝臟三個組HE 染色圖片基本情況與6 周組相似，但富硒靈芝12 周組組比較富硒靈芝6 周組進一步好轉，詳見圖1。

圖1 大鼠肝臟HE 染色Fig.1 HE staining of rat liver

2.2 大鼠肝功能比較

2.2.1 治療6 周后大鼠肝功能比較

治療6 周后大鼠LDH、AST 以及ALT 富硒靈芝6 周組與模型對照6 周組相比，P＜0.05;堿性磷酸酶(AKP)、r-谷氨酰轉移酶(r-GT)富硒靈芝組與模型組相比，雖然沒有統計學意義，但仍可以看出明顯的變化，詳見表1。

表1 各組大鼠肝功能治療6 周指標比較(n=10，)Table 1 Comparison of liver function indicators of different groups with 6 weeks’treatment (n=10，)

表1 各組大鼠肝功能治療6 周指標比較(n=10，)Table 1 Comparison of liver function indicators of different groups with 6 weeks’treatment (n=10，)

注:與模型對照組比較，* P＜0.05。Note:Compare with model control group，* P＜0.05.

2.2.2 治療12 周后大鼠肝功能比較

治療12 周后大鼠LDH 與AST、ALT 富硒靈芝12 周組與模型對照12 周組相比，P＜0.05，AKP 與r-GT 富硒靈芝12 周組與模型對照12 周組相比，無統計學意義，詳見表2。

表2 各組大鼠肝功能治療12 周指標比較(n=10，)Table 2 Comparison of liver function indicators of different groups with 12 weeks’treatment (n=10，)

表2 各組大鼠肝功能治療12 周指標比較(n=10，)Table 2 Comparison of liver function indicators of different groups with 12 weeks’treatment (n=10，)

注:與模型對照組比較，* P＜0.05。Note:Compare with model control group，* P＜0.05.

2.3 大鼠氧化和抗氧化能力比較

2.3.1 治療6 周后大鼠氧化和抗氧化能力比較

富硒靈芝6 周組血清GSH、血清MDA、肝臟SOD、肝臟MDA 以及肝臟GSH 與模型對照組比較有明顯的統計學意義，P＜0.05，詳見表3。

表3 治療6 周后大鼠氧化和抗氧化能力比較(n=10，)Table 3 Comparison of oxidation and antioxidant capacity of different groups with 6 weeks’treatment (n=10，)

表3 治療6 周后大鼠氧化和抗氧化能力比較(n=10，)Table 3 Comparison of oxidation and antioxidant capacity of different groups with 6 weeks’treatment (n=10，)

注:與模型對照組比較，* P＜0.05。Note:Compare with model control group，* P＜0.05.

2.3.2 治療12 周后大鼠氧化和抗氧化能力比較

富硒靈芝血清GSH、血清MDA、肝臟SOD、肝臟MDA、肝臟GSH 與模型組相比P＜0.05，詳見表4。

表4 治療12 周后大鼠氧化和抗氧化能力比較(n=10，)Table 4 Comparison of oxidation and antioxidant capacity of different groups with 12 weeks’treatment (n=10，)

表4 治療12 周后大鼠氧化和抗氧化能力比較(n=10，)Table 4 Comparison of oxidation and antioxidant capacity of different groups with 12 weeks’treatment (n=10，)

注:與模型對照組比較，* P＜0.05。Note:Compare with model control group，* P＜0.05.

2.4 SREBF-1 與ACCα mRNA 表達

2.4.1 大鼠SERBF-1 mRNA 表達

與模型對照組相比，富硒靈芝6 周組大鼠肝臟SERBF-1 的mRNA 表達稍有改善，但差別無統計學意義(P ＞0.05)。12 周SERBF-1 的mRNA 表達與模型對照組相比有明顯的統計學意義，經檢驗P＜0.05(圖2)。

圖2 肝臟組織中SREBF-1 mRNA 的表達Fig.2 Liver SREBF-1 mRNA expression

2.4.2 大鼠ACCα mRNA 表達

與模型對照組相比，富硒靈芝6 周組大鼠肝臟ACCα 的mRNA 表達即具有統計學意義(P＜0.05)。12 周ACCα 的mRNA 表達幾乎恢復到正常的水平，詳見圖3。

圖3 肝臟組織中ACCα mRNA 的表達Fig.3 Liver ACCα mRNA expression

2.5 SREBF-1 與ACCα 酶蛋白表達

2.5.1 大鼠SERBF-1 蛋白表達

富硒靈芝6 周組與模型對照6 周組相比，差別具無統計學意義(P ＞0.05);12 周富硒靈芝組與模型對照組相比，差距具有統計學意義P＜0.05(圖4)。

2.5.2 大鼠ACCα 蛋白表達

富硒靈芝6 周組與模型對照6 周組相比，差別具有統計學意義(P＜0.05);12 周富硒靈芝組與模型對照組相比，差距也具有統計學意義，同時富硒靈芝12 周組要明顯的好于富硒靈芝6 周組，幾乎達到了空白對照組的水平(圖5)。

圖4 肝臟組織中SREBF-1 蛋白的表達Fig.4 Liver SREBF-1 protein expression

圖5 肝臟組織中ACCα 蛋白的表達Fig.5 Liver ACCα protein expression

圖6 空腹胰島素抵抗指數Fig.6 Fasting insulin resistance index

2.6 空腹血糖胰島素抵抗指數

空腹胰島素抵抗指數比較，6 周時模型組大鼠明顯要高于空白組，經富硒靈芝治療后，只有略微的降低，12 周時富硒靈芝組胰島素抵抗指數與模型組相比呈現出統計學意義(P＜0.05)，詳見圖6。

3 討論

NAFLD 在臨床上指病變主體為肝小葉，以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征，但卻無過量飲酒史的一種病理綜合征，其疾病譜包括單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、及其相關脂肪性肝纖維化和肝硬化等［3］。2012 年沈峰等［4］在上海國際消化系統疾病會議中報道顯示在我國當前城市人口NAFLD 的發生率約31%，我國貧困地區NAFLD 的患病率也在12%左右。早期的研究認為，NAFLD 預后良好，進展緩慢甚者基本不進展。但近來研究顯示，NAFLD 如果不加以治療或預防，可導致約20%的NAFLD 患者進展為肝硬化，其中30%～40%患者死于肝相關疾病［3］，因此當前NAFLD已成為威脅我國人民健康的疾病之一。

NAFLD 發病機理的研究，目前醫學界普遍接受的是1998 年Day［5］提出的“二次打擊學說”，“二次打擊學說”分為“第1 次打擊”和“第2 次打擊”二個部分，“第1 次打擊”即指脂肪在肝細胞內過量儲積;有研究顯示［6］，IR 是NAFLD 第一次打擊的始動及中心環節，可能貫穿于NAFLD 發病全過程。IR的高低與調節脂肪生成的轉錄因子SREBF-1 密切相關［7］。胰島素的高表達是造成SREBF-1 升高的關鍵，SREBF-1 是調節肝臟脂肪合成有關的酶，其過度表達可使ACCα 的mRNA 表達水平升高，ACCα主要參與脂肪酸的合成［8］，它是催化脂肪酸合成的第一步反應，即ACCα 合成丙二酰輔酶A，丙二酰輔酶A 在脂肪酸碳鏈延長酶系作用下合成長鏈脂肪酸，促進脂肪變性發生，造成脂肪顆粒在肝臟內聚集，從而導致非酒精性脂肪肝的發生。本文的研究結果提示:用富硒靈芝水給予高脂飲食造成的NAFLD 大鼠治療，胰島素抵抗指數在6 周時發生了微小改變，到12 周時呈現出統計學意義，大鼠SREBF-1mRNA 和蛋白變化趨勢與胰島素抵抗指數變化一致，而ACCα mRNA 和蛋白表達則相當明顯，其不僅6 周即發生了明顯的改變，12 周時ACCα 的表達幾乎恢復到正常對照組的水平(P＜0.05)，分析原因可能是由于富硒靈芝在初始時不可以直接通過降低胰島素抵抗來直接作用與大鼠SREBF-1 基因的表達，但卻可以明顯抑制SREBF-1 管控因子ACCα 的表達，通過抑制大鼠ACCα mRNA 和蛋白的表達，有效的保護了脂肪顆粒在肝臟內的積累，而在12 周時，其SREBF-1 的表達呈現出統計學意義(P＜0.05)，這可能是由于ACCα 的降低，促進了肝臟脂肪顆粒的代謝，從而進一步反作用于SREBF-1的表達，綜合提示:富硒靈芝可有效降低大鼠肝臟SREBF-1 與ACCα 的表達，從而減緩了首次打擊帶來的危害，以達到改善肝功能，保護肝臟的功效。

氧化應激與脂質過氧化損傷是脂肪肝受到第二次打擊進一步發展的重要因素［9］。當肝細胞內脂質過度堆積到一定程度時，就會出現以線粒體為中心的一條或多條途徑促進氧化應激，導致脂質過氧化，最終加速肝細胞損傷，甚至導致肝細胞死亡及肝纖維化。超氧化物歧化酶(SOD)［10］是超氧離子自由基的專一特效金屬歧化酶，通過清除自由基，起到保護機體的作用，它對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護肝細胞免受損傷。脂質過氧化后產生MDA 增加，MDA 增加使細胞內抗氧化劑SOD 消耗增加，含量顯著性下降［11］。本文的研究結果顯示:富硒靈芝治療6 周后，與模型對照組相比，血清GSH、血清MDA，肝臟SOD、肝臟GSH 以及肝臟MDA 相比，均發生了明顯的改變，P＜0.05。富硒靈芝治療12 周后，血清GSH、血清MDA，肝臟SOD、肝臟GSH 以及肝臟MDA5個指標與模型對照組相比，變化更加明顯(P＜0.05)，其中肝臟SOD 水平幾乎回到了正常的水平，結合本次治療后，肝功能水平的明顯好轉，綜合提示:富硒靈芝可明顯提高高脂飲食所誘導的非酒精性脂肪肝病抗氧化能力，降低肝臟二次打擊的危害，有效的保護肝臟。

綜上所述，本文研究結果顯示:富硒靈芝可通過抑制非酒精性脂肪肝病大鼠的肝臟組織ACCα 蛋白的表達，同時減弱二次打擊學說中第二次打擊對肝臟的進一步傷害，以降低肝臟的氧化能力，提高抗氧化能力，從而達到降低肝異常指數，治療非酒精性脂肪肝病，但本次治療周期時間為12 周，提示。富硒靈芝治療非酒精性脂肪肝可能藥效療程較長，需長期服用。

1 Xiang CG(向昌國)，Li WF(李文芳)，Ren H(任浩)，et al.Selenium content determination in edible parts of crops in Zhangjiajie city.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2012，24:1084-1088.

2 Yang Y(楊洋)，Wu XY(吳小勇)，Zhang Z(張湛)，et al.Fermentation of Ganoderma lucidum for selenium enrichment and the antioxidant capability of the protein product.Mod Food Sci Technol(現代食品科技)，2010，26:1349-1353.

3 Zhu LX，Baker SS，Gill C，et al.Characterization of gut microbiomes in nonalcoholic steatohepatitis(NASH)patients:A connection between endogenous alcohol and NASH.Hepatology，2013，57:601-609.

4 Tanwar S，Trembling PM，Thorburn D，et al.PWE-286 Direct serum markers are more accurate than simple marker panels for the detection of fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).Gut，2012，61:A414.

5 Shen F(沈峰)，Wang YQ(汪余勤)，Fan GJ(范建高).2012 Shanghai international meeting of digestive diseases.Chin J Frontiers Med Sci，Electr Ver(中國醫學前沿雜志.電子版)，2012，4:1-4.

6 Day CP.Steatohepatitis:a tale of two hits?Gastroenterol，1998，114:842.

7 Polyzos SA，Kountlouras J，Zavos C.Nonalcoholic fatty liver disease:the pathogenedc roles of insulin resistance and adipocytokines.Curr Mol Med，2009，9:299-314.

8 Capel F，Rolland-Valognes G，Dacquet C，et al.Analysis of sterol-regulatory element-binding protein 1c target genes in mouse liver during aging and high-fat diet.J Nutrigenet Nutrigenomics，2013，6:107-122.

9 Lim JS，Mietus-Snyder M，Valente A，et al.The role of fructose in the pathogenesis of NAFLD and the metabolic syndrome.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2010，7:251-264.

10 Koeka GH，Liedorpa PR，Bast A.The role of oxidative stress in non-alcoholic steatohepatitis.Clin Chim Acta，2011，412:1297-1305.

11 Kathirvel E，Chen P，Morgan K，et al.Oxidative stress and regulation of anti-oxidant enzymes in cytochrome P4502E1 transgenic mouse model of non-alcoholic fatty liver.J Gastroenterol Hepatol，2010，25:1136-1143.