龍葵生物堿自微乳化制劑配方研究

張 威，賈曉斌，劉美輝，朱勁華*

1江蘇建康職業(yè)學(xué)院，南京 210029;2 江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京 210028

龍葵(Solanum nigrum)別名苦葵、天茄子、老鴉眼睛草、水茄、天泡果、天泡草、老鴉酸漿草、山海椒等［1］，主要用于抗癌。李時珍著《本草綱目》記載:其味苦，微甘，寒，滑，無毒。主治癰疽腫毒，跌打損傷，功能消腫散血，通利小便。臨床上廣泛運用龍葵水煎劑或注射劑治療宮頸癌、食道癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、絨毛膜上皮癌、卵巢癌、肉瘤等多種惡性腫瘤［2］，因而龍葵也被中醫(yī)學(xué)列為十大抗腫瘤中草藥之一。近年來，龍葵的抗癌作用受到廣泛關(guān)注，對其抗癌有效成分進行大量的研究證明，其抗腫瘤的主要成分為生物堿［3-6］;如賈艷菊等［5］用MTT 法觀察龍葵生物堿的體外抗腫瘤作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100～800 μg/mL 的龍葵生物堿對HeLa 細胞的生長均表現(xiàn)出一定的抑制作用。李明慧等［7］觀察龍葵甾體類生物堿對荷瘤(S180)小鼠及對Lewis 肺癌移植瘤小鼠的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)龍葵甾體類生物堿不僅具有抑制腫瘤增長的作用，還可顯著提高荷瘤小鼠血清TNFa、IL-2、IL-6、IL8 的水平。李志雄等［8］研究龍葵堿對前列腺癌LNCaP 及Du145 細胞系的抑制作用及機制，發(fā)現(xiàn)龍葵堿可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)兩種細胞凋亡的發(fā)生，能將腫瘤細胞周期阻滯在S 期，由此產(chǎn)生抑制增殖作用。龍葵生物堿因具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)而難溶于水，可選擇自微乳給藥系統(tǒng)［9］(Self-microe mulsifying Drug Delivery System，SMEDDS)作為龍葵生物堿的給藥載體，以提高其生物利用度，促進藥物的吸收。自乳化藥物傳遞系統(tǒng)是由油相、非離子表面活性劑和助表面活性劑組成的固體或液體制劑，其基本特征是可在胃腸道內(nèi)或環(huán)境溫度適宜(通常指體溫37 ℃)及溫和攪拌的條件下，自發(fā)乳化形成粒徑在100～500 nm 左右的乳劑。而當親水性表面活性劑(HLB ＞12)含量較高(≥40%，W/W)或同時使用助乳化劑時，在輕微攪動下可制得更精細的乳劑(粒徑50 nm 左右)，則被稱為自微乳化藥物傳遞系統(tǒng)［10］。目前最常用自乳化藥物傳遞系統(tǒng)的乳化劑有乙氧基聚氧乙烯甘油酯、聚氧乙烯油酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚及吐溫等;常用的助乳化劑多為中、短鏈的一元或二元醇，如乙醇、丙二醇等;常用的油相有蓖麻油、豆油、花生油、橄欖油、肉豆蔻酸異丙酯、脂肪酸三酰甘油等［11］。本文選用常見的乳化劑、助乳劑及油相作為龍葵生物堿的自微乳制劑配方，對各因素進行研究，以找到龍葵生物堿自微乳制劑的最佳配方［12］，為進一步通過自乳化藥物傳遞系統(tǒng)給藥的藥效研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器和試藥

85-2 型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司);AL204 型梅特勒-托利多十萬分之一分析天平和百萬分之一天平(上海亞津電子科技有限公司);JJ-800 型精密電子天平(美國雙杰儀器公司);H.H.S 數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(上海錦凱科學(xué)儀器有限公司);3000HSA 型激光粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司);島津UV-2450/2550 紫外-可見分光光度計(島津公司)。

吐溫-20(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，聚氧乙烯辛基苯基醚(OP 乳化劑，上海玖意化學(xué)試劑有限公司)，油酸(上海實意化學(xué)試劑有限公司)，1，2-丙二醇(PPD，上海譜振生物科技有限公司)，龍葵總生物堿提取物(自提，批號:20120302)，注射用水(南京易普易達科技發(fā)展有限公司)。

2 方法與結(jié)果

微乳的粒徑是SMEDDS 質(zhì)量控制和處方篩選的重要指標，也是區(qū)分乳劑、亞微乳、微乳的重要指標。本試驗微乳的制備是按照下列各表固定處方中表面活性劑、助表面活性劑、油相中的用量，將表面活性劑、助表面活性劑、油相混合均勻，然后加入龍葵甾體生物總堿，充分攪拌使提取物溶解完全，得到棕紅色SMEDDS 濃縮液，經(jīng)稀釋后通過馬爾文粒度儀測定其粒徑。又因為透光率和自微乳的粒徑有的緊密相關(guān)性，即對于粒徑足夠小且分散穩(wěn)定的微乳而言，透光率越高，乳滴的粒徑越小，自乳化效果也就越好。將所得SMEDDS 濃縮液，加水稀釋，在600 nm 下測定透光率［13］。以各因素變化對粒徑和透光率的影響，觀察各因素對乳化效果的影響。

2.1 表面活性劑吐溫-20 的用量對透光率的影響［14］

按照表1 列出的量，將吐溫-20、OP 乳化劑、油酸、1，2-丙二醇混合，再將龍葵甾體總生物堿提取物10 mg 加入，充分攪拌使生物堿提取物溶解完全，得該處方自微乳濃縮液。精密取出1 mL 微乳濃縮液加入到10 mL 注射用水中，輕微震蕩后測量其粒徑，并以透光率為指標，在600 nm 處測定透光率的值，結(jié)果見表1。

表1 吐溫-20 對粒徑和透光率的影響Table 1 Effect of Tween-20 on particle size and transmittance of SMEDDS

從試驗結(jié)果可見，吐溫-20 的最佳用量在200～300 mg 之間。從上述實驗結(jié)果可以看出，雖然吐溫-20 用量為300 mg 時粒徑最小(25.3 nm)、透光率最高(81.3%)，較吐溫-20 用量為200 mg 時用量增加了50%，粒徑只減小3 nm，透光率只增加2%。為了便于篩選，綜合考慮吐溫-20 的用量及其對粒徑的影響，下面試驗中吐溫-20 的用量均以200 mg 加入。

2.2 表面活性劑OP 乳化劑的用量對透光率的影響［15］

按照表2 列出的量，將吐溫-20、OP 乳化劑、油酸、1，2-丙二醇混合，再將龍葵甾體總生物堿提取物10 mg 加入，充分攪拌使生物堿提取物溶解完全，得該處方自微乳濃縮液。精密取出1 mL 微乳濃縮液加入到10 mL 注射用水中，輕微震蕩后測量其粒徑，并以透光率為指標，在600 nm 處測定透光率的值，結(jié)果見表2。

表2 OP 乳化劑對粒徑和透光率的影響Table 2 Effect of polyoxyethylene octyl phenyl ether on particle size and transmittance of SMEDDS

從試驗的結(jié)果可見，OP 乳化劑的用量以200 mg 為最佳。從上述實驗結(jié)果可以看出，隨著OP 乳化劑使用量的增加，微乳的粒徑先減小后增大，整個體系透光率的變化是先增大后減小。當OP 乳化劑的用量為200 mg 時，粒徑最小，透光率最大。為了便于篩選，下面試驗中均以O(shè)P 乳化劑200 mg 的用量加入。

2.3 油酸的用量對微乳透光率的影響

按照表3 列出的量，將吐溫-20、OP 乳化劑、油酸、1，2-丙二醇混合，再將龍葵甾體總生物堿提取物10 mg 加入，充分攪拌使生物堿提取物溶解完全，得該處方自微乳濃縮液。精密取出1 mL 微乳濃縮液加入到10 mL 注射用水中，輕微震蕩后測量其粒徑，并以透光率為指標，在600 nm 處測定透光率的值，結(jié)果見表3。

表3 油酸對粒徑和透光率的影響Table 3 Effect of oleic acid on particle size and transmittance of SMEDDS

從試驗的結(jié)果可見，油酸用量以50 mg 較佳。根據(jù)“膨脹膠束理論”，油相的加入會將原來混合乳化劑的膠束溶液中的膠束基團進一步溶脹，導(dǎo)致乳滴粒徑的逐漸增大，從而使整個體系的透光率逐漸減小。實驗結(jié)果表明隨著油相量的增加，微乳相應(yīng)的粒徑應(yīng)隨油相含量的增大而增加，其透光率大幅度減少。這與“膨脹膠束理論”所闡明的結(jié)果相一致。但同時發(fā)現(xiàn)，加入的油相在一定范圍(40～60 mg)之內(nèi)并沒有使整個體系的粒徑和透光率發(fā)生很大的變化，這可能和體系中使用了混合表面活性劑有關(guān)。因為混合表面活性劑的存在使得O/W 型微乳的粒子表面的柔韌性以及抗水稀釋能力大大加強，所以在一定范圍內(nèi)，混合表面活性劑、助表面活性劑可以很好的控制油/水界面張力在一定范圍內(nèi)。

2.4 助表面活性劑1，2-丙二醇的用量對透光率的影響

按照表4 列出的量，將吐溫-20、OP 乳化劑、油酸、1，2-丙二醇混合，再將龍葵甾體總生物堿提取物10 mg 加入，充分攪拌使生物堿提取物溶解完全，得該處方自微乳濃縮液。精密取出1 mL 微乳濃縮液加入到10 mL 注射用水中，輕微震蕩后測量其粒徑，并以透光率為指標，在600 nm 處測定透光率的值，結(jié)果見表4。

表4 1，2-丙二醇對粒徑和透光率的影響Table 4 Effect of 1，2-propanediol on particle size and transmittance of SMEDDS

本試驗使用了1，2-丙二醇作為助表面活性劑，主要為了調(diào)節(jié)微乳體系的HLB 值。從試驗結(jié)果看，隨著助表面活性劑用量的增加，整個體系粒徑開始慢慢變小，透光率隨之增大，但達到一定階段之后，即使再增大助表面活性劑的用量也不能使其粒徑和透光率發(fā)生大的改變。從盡量減少微乳體系中表面活性劑、助表面活性劑的角度出發(fā)，1，2-丙二醇的加入量以500 mg 為佳。

2.5 龍葵總生物堿提取物的用量對微乳透光率的影響

按照表5 列出的量，將吐溫-20、OP 乳化劑、油酸、1，2-丙二醇混合，再將龍葵甾體總生物堿提取物以不同的量加入，充分攪拌使生物堿提取物溶解完全，得該處方自微乳濃縮液。精密取出1 mL 微乳濃縮液加入到10 mL 注射用水中，輕微震蕩后測量其粒徑，并以透光率為指標，在600 nm 處測定透光率的值，結(jié)果見表5。

表5 龍葵總生物堿提取物的用量對粒徑和透光率的影響Table 5 Effect of amount of S.nigrum alkaloid on particle size and transmittance of SMEDDS

從試驗結(jié)果看，當體系載藥后，增個體系的粒徑不斷增大。當龍葵甾體總生物堿提取物在5～15 mg 時，粒徑增大、透光率減小較緩，但當龍葵甾體總生物堿提取物由15 mg 變成20 mg 時，粒徑幾乎增大了一倍，透光率減小了15%。綜合考慮載藥量和粒徑增大兩個方面的因素，選擇體系中的龍葵總生物堿提取物的加入量以10 mg 為佳。

3 結(jié)論

處方中乳化劑的用量越大，其微乳的毒性相應(yīng)也會增加，所以實驗中在保證微乳自乳化效率的前提下，盡可能的降低乳化劑的含量。最終確定最佳處方為:吐溫-20 200 mg，OP 乳化劑200 mg，油酸40 mg，1，2-丙二醇500 mg，龍葵總生物堿提取物10 mg。此SMEDDS 配方為進一步通過正交試驗、星點設(shè)計等方式進一步探索龍葵生物堿自微乳化制劑最佳配方奠定必要的基礎(chǔ)。

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