太行菊和野菊不同器官醇提液抗氧化活性比較研究

張曉雯，魏東偉*，孫武勇，葉永忠

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002;2 河南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，鄭州 450003

隨著對自由基與疾病關(guān)系認知的深入，從天然植物中尋找可清除機體過量自由基的植物源抗氧化劑成為現(xiàn)代保健、醫(yī)藥等行業(yè)的熱點。菊花為我國傳統(tǒng)藥食同源中藥，菊花酒可明目、降血壓，有減肥、補肝氣、安腸胃等功效。酒自身具活血功效，較傳統(tǒng)水煎與沸水沖飲，菊花泡酒可更大程度提高藥效，具有深入研究的價值。太行菊［Opisthopappus taihangensis (Ling)Shih］為太行菊屬(Opisthopappus Shih)多年生宿根草本植物，隸屬菊科菊蒿亞族。該屬有長裂太行菊和太行菊兩個我國特有種，主要分布在河南新鄉(xiāng)、焦作、林州和山西陵川、晉城等太行山區(qū)。其花色潔白，株型低矮整齊，花期較長，植物通體富含芳香油，干后香味持久［1，2］。在其產(chǎn)地，太行菊常作野菊入藥，其香氣濃郁，當(dāng)?shù)厝罕姺从撑莶栾嬘没蛩幱脙r值遠優(yōu)于其近緣屬的傳統(tǒng)藥食兼用野菊。

本研究組前期工作表明，太行菊花和野菊花水提液具有較高的抗氧化活性［3］，太行菊花葉莖各器官綠原酸、蘆丁、槲皮素、木犀草素和芹菜素五種酚類物質(zhì)的總含量高于野菊對應(yīng)器官［4］。現(xiàn)有大量研究認為，黃酮多酚類物質(zhì)是多種植物抗氧化活性的重要貢獻因素［5，6］。因此，本文主要集中研究太行菊和野菊不同器官醇提液的抗氧化活性、紫外-可見吸收光譜特性以及抗氧化活性與總黃酮和多酚含量的相關(guān)性，為我國特有植物太行菊的深入研究與合理開發(fā)利用提供一定依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

材料:太行菊與野菊于2011 年10 月采集于河南省新鄉(xiāng)衛(wèi)輝太行山區(qū)，經(jīng)葉永忠教授鑒定。取葉、花、莖三部位為供試材料，其中莖為幼莖部分。試樣經(jīng)分開，陰干，粉碎，過40 目篩后于干燥器中備用。

試劑:ABTS［2，2-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)］，DPPH(2，2-二苯基-1-古肼基自由基)，蘆丁(≥98%)，福林酚試劑，沒食子酸(≥98%)購自Sigma-Aldrich 公司;Trolox(奎諾二甲基丙烯酸酯C14H18O4)購自上海浩然生物科技有限公司;K2S2O3、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、Na2CO3、無水乙醇均為分析純。所有試劑使用前未經(jīng)處理，溶液未經(jīng)特殊說明均用蒸餾水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

2 實驗方法

2.1 樣品的制備

精密稱取0.03 g(ABTS 體系)或0.15 g(DPPH體系)菊試樣，加入10 mL 無水乙醇，不同溫度(40、55、65 ℃)水浴加熱反應(yīng)4 h，提取后冷卻至室溫，5000 rpm 離心15 min，取上清液，稀釋至不同濃度備用。

2.2 抗氧化活性測定

2.2.1 清除ABTS 自由基的能力

精密稱取0.0033 g 高硫酸鉀和0.0189 g ABTS，用去離子水溶解混合定容于2 mL 棕色容量瓶，避光靜置12～16 h，得ABTS 儲備液。使用前用無水乙醇稀釋至ABTS 的吸光值414 nm 處為1.0左右，儲備液當(dāng)天配置使用。將不同質(zhì)量濃度的樣品醇提液按表1 加樣，各組溶液充分混勻，30 ℃恒溫水浴反應(yīng)6 min。用分光光度法測定反應(yīng)體系414 nm 處的吸光值。根據(jù)吸光值變化判斷試樣對ABTS 自由基清除能力。

2.2.2 清除DPPH 自由基的能力

精密稱取0.0132 g DPPH，無水乙醇溶解并定容于250 mL，即得DPPH 儲備液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩⒉煌|(zhì)量濃度的樣品醇提液按表1 加樣，各組溶液充分混勻，37 ℃恒溫水浴反應(yīng)20 min。用分光光度法測定反應(yīng)體系在最大吸收波長521 nm 處的吸光值，根據(jù)吸光值變化判斷試樣對DPPH 自由基清除能力。

表1 ABTS/DPPH 自由基反應(yīng)體系(1 單位=0.7 mL 總體積:3.5 mL)Table 1 Reaction systems of ABTS/DPPH scavenging assay (1 unit=0.7 mL Total bulk:3.5 mL)

其中:A0為樣品空白時吸光值;AX為含有樣品提取物時吸光值;A0'為樣品提取物本底吸光值。

2.2.3 Trolox 等效抗氧化能力(Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC)計算

準(zhǔn)精密稱取0.0125 g Trolox 粉末，無水乙醇溶解轉(zhuǎn)移并定容于50 mL 容量瓶，得Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述Trolox 樣液用無水乙醇按需要稀釋為不同濃度，分別于ABTS 和DPPH 體系測定其吸光值，計算抑制率。以Trolox 濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得ABTS 體系的曲線方程y=-5.1801 +1.1849x，R=0.9968;DPPH 體系的曲線方程y=0.52088x-5.054，R=0.9996。通過上述方程計算Trolox 在兩個體系的IC50(清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度)值，Trolox 的IC50值與樣品IC50的比值即為樣品的RACT50。

測量位置應(yīng)做統(tǒng)一規(guī)定，確保上次檢修與本次檢修在同一位置上測量，以減少誤差。齒高的降低值與上次修后汽封間隙之和，即為本次修前汽封間隙。

2.3 紫外-可見光譜特性的測定

精密稱取0.3 g 樣品同1.3.1 提取步驟，得樣品不同提取條件濃度為3 g/L 的提取原液，依需要稀釋至0.5 g/L 保持菊樣品吸光值低于2.0，以提取溶劑無水乙醇為對照，在200～800 nm 范圍間進行紫外-可見吸收光譜掃描。

2.4 總多酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu 比色法［4］，結(jié)果以相當(dāng)沒食子酸(GAE)的毫克數(shù)表示(mg GAE/g)。

2.5 總黃酮的含量測定

采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法［4］，結(jié)果以相當(dāng)蘆丁(Rutin)的毫克數(shù)表示(mg Rutin/g)。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用origin 6.1 進行數(shù)據(jù)處理和相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 太行菊和野菊不同器官醇提液的抗氧化活性

圖1 太行菊和野菊不同器官不同提取溫度醇提液ABTS(A 40 ℃，C 65 ℃)和DPPH(B 40 ℃，D65 ℃)自由基清除效果Fig.1 ABTS (A 40 ℃，C 65 ℃)and DPPH (B 40 ℃，D65 ℃)radical scavenging capacity of alcoholic extracts of different organs of O.taihangensis and D.indicum

ABTS+·是一種較穩(wěn)定的自由基，其無水乙醇或磷酸緩沖液呈藍綠色，抗氧化活性物質(zhì)可抑制其產(chǎn)生并使反應(yīng)體系褪色，表現(xiàn)出吸光度降低，通過測定加入活性物質(zhì)前后414 nm 或731 nm 處吸光值的減弱程度，評價試樣清除ABTS 自由基能力。顏色變得越淺，表明活性物質(zhì)清除ABTS 自由基的能力越強。DPPH·是一種在有機溶劑中穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm 附近有強吸收，抗氧化活性物質(zhì)存在時，其所含的孤對電子被配對使反應(yīng)體系褪色，吸光值減弱或消失，通過測定最大吸收波長處吸光值的減弱程度評價試樣對DPPH 自由基能力。太行菊和野菊不同器官醇提液的抗氧化活性見圖1.圖1 表明，太行菊和野菊不同器官醇提液對ABTS 和DPPH 自由基均有一定清除能力，且其清除率隨提取液添加量的增加而增高，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。在同一添加量時，太行菊葉較其他樣品清除能力更強，其次為野菊葉，太行菊花和太行菊莖(幼莖)清除能力較接近，接著為野菊花，而野菊莖則最弱，兩種方法的活性測定結(jié)果大體趨勢一致。

評價一種物質(zhì)的抗氧化活性，通常以抑制率Inhibition(I)或半抑制濃度IC50(清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度)作為衡量指標(biāo)。國際上多用Trolox 等同抗氧化活性值(TEAC)評價抗氧化能力，即相當(dāng)于同等清除能力的Trolox 濃度的濃度數(shù)。以Trolox 的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)分別繪制ABTS 和DPPH 自由基清除能力測定體系的曲線方程，根據(jù)曲線方程計算Trolox 的IC50，詳見1.3.2 實驗部分。Trolox 在兩個評價體系的IC50分別為ABTS 體系46.57 μmol/L，DPPH 體系105.69 μmol/L。同理，分別計算菊試樣ABTS 和DPPH 體系的IC50，Trolox 的IC50與試樣的IC50比值即為試樣的RACT50。IC50和RACT50值可表征試樣抗氧化活性，IC50值越小，RACT50則越大，表示此試樣的抗氧化活性越強，反之則相對較弱。各試樣的IC50和RACT50值見表2。由表2 可看出，相同提取溫度時兩種菊試樣不同評價體系抗氧化活性均有如下順序:太行菊葉＞野菊葉＞太行菊花≈太行菊莖＞野菊花＞野菊莖。例65 ℃時，DPPH 和ABTS 體系菊試樣醇提液的RACT50(μmol/g)值趨勢一致，分別為ABTS 體系，太行菊葉287.29 ＞野菊葉197.33 ＞太行菊花122.61 ＞太行菊莖89.23 ＞野菊花86.51 ＞野菊莖33.69;DPPH 體系，太行菊葉98.58 ＞野菊葉52.85＞太行菊莖51.95 ＞太行菊花32.84 ＞野菊花28.61＞野菊莖13.35。因此，太行菊不同器官的醇提液對ABTS 和DPPH 自由基清除能力均高于野菊對應(yīng)器官，較于近緣屬的野菊，太行菊可能具有更好的保健和藥用功效，值得深入研究。

表2 太行菊和野菊不同器官的IC50(g/L)與RACT50(μmol/g)及總多酚(mg GAE/g)和總黃酮(mg Rutin/g)含量Table 2 IC50(g/L)，RACT50(μmol/g)and contents of total flavonoids (mg Rutin/g)and phenolics (mg GAE/g)of O.taihangensis and D.indicum

3.2 紫外-可見吸收光譜特性

為探明太行菊和野菊醇提液的抗氧化活性成分，對菊試樣各器官醇提液進行紫外-可見吸收光譜特性研究，見圖2。由圖2 中可看出，太行菊和野菊不同器官醇提液均在220～280 nm，300～400 nm 間有兩個明顯吸收帶，該吸收特征符合黃酮多酚類化合物的光譜特性，表明提取液中富含黃酮多酚類物質(zhì)［7］。此外可知，兩種菊花醇提液在同一質(zhì)量濃度(0.5 g/L)的吸收峰值為:太行菊葉＞野菊葉＞太行菊花≈太行菊莖＞野菊花＞野菊莖，與圖1 和表2所示兩種菊花醇提液清除ABTS 和DPPH 自由基效能結(jié)果一致。由此可推斷，太行菊和野菊各器官醇提液自由基清除能力與浸出的黃酮多酚成分密切相關(guān)。

圖2 太行菊和野菊不同器官醇提液紫外-可見光譜特性(0.5 g/L)Fig.2 UV-Vis spectra of alcoholic extracts from different organs of O.taihangensis and D.indicum (0.5 g/L)

圖3 太行菊和野菊不同器官不同提取溫度醇提液的紫外-可見光譜吸收值Fig.3 UV-Vis absorbance values of alcoholic extracts from different organs of O.taihangensis and D.indicum under 3 testing temperatures

與圖2 相對應(yīng)的兩種菊不同提取溫度醇提液的紫外-可見吸收峰值變化趨勢見圖3。由圖3 可知，太行菊和野菊不同器官除太行菊葉紫外-可見吸收峰值(a.u.)基本接近，分別為1.539、1.541、1.583外，其他器官均表現(xiàn)出隨溫度的升高紫外-可見吸收峰值逐漸增大，例40、55、65 ℃，太行菊花依次為0.479、0.534、0.796;野菊花0.403、0.503、0.564;野菊葉0.591、0.789、0.981;太行菊莖0.536、0.566、0.770;野菊莖0.174、0.241、0.262。由此可推斷，高溫提取液黃酮多酚類物質(zhì)浸出量增高。但對應(yīng)器官的吸收峰值與抗氧化活性趨勢沒有表現(xiàn)完全一致性，可能是提取溫度影響菊試樣中其他活性成分的浸出或影響一些成分間的協(xié)同作用而導(dǎo)致該結(jié)果。

3.3 太行菊和野菊不同器官總多酚與總黃酮含量

為研究黃酮多酚類化合物與抗氧化活性的關(guān)系，分別采用硝酸鋁絡(luò)合分光光度法和Folin-Ciocalteu 比色法研究兩種菊花不同器官中總黃酮與多酚的含量，見表2。由表2 可知，太行菊和野菊不同器官總黃酮和多酚含量順序與其醇提液清除ABTS 和DPPH 自由基的效能順序基本一致，即總黃酮含量(mg Rutin/g)，太行菊葉115.95 ＞野菊葉76.99 ＞太行菊花69.90 ＞野菊花55.19 ＞太行菊莖44.83 ＞野菊莖;總多酚含量(mg GAE/g)，太行菊葉153.44＞野菊葉136.93 太行菊花114.83 ＞野菊花100.18＞太行菊莖85.65 ＞野菊莖39.78。其中，太行菊不同器官總黃酮與總多酚含量均高于野菊對應(yīng)器官，且同一器官中總多酚含量高于總黃酮。Xavier.vitrac［8］研究組通過評價30 種工業(yè)用植物提取液酚類物質(zhì)和其抗氧化活性實驗證實，植物抗氧化活性與其酚類物質(zhì)含量密切相關(guān)，酚類物質(zhì)是其抗氧化活性的重要貢獻因素。本研究結(jié)果支持前人的研究。

3.4 相關(guān)性分析

為進一步了解提取物組分對其抗氧化能力的貢獻，對太行菊和野菊不同器官醇提液的總黃酮與多酚含量及抗氧化能力測定結(jié)果間進行相關(guān)性分析，見表3 和圖4。

以40 ℃提取的菊試樣醇提液抗氧化活性為例說明，如圖4A 所示，以供試菊不同器官ABTS 體系RACT50值(x)為自變量，總多酚、總黃酮含量(y)為因變量進行相關(guān)性分析，得回歸方程的相關(guān)系數(shù)。同樣的方法可獲得供試菊DPPH 體系的RACT50與總多酚、總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)(圖4B)，總多酚與總黃酮含量間(圖4C)，ABTS 與DPPH 兩種抗氧化活性方法間的相關(guān)性(圖4D)。因此，由表3 和圖4可知，太行菊和野菊不同器官不同溫度的醇提液自由基清除能力與總多酚和總黃酮的含量均呈顯著正相關(guān)，其中ABTS 體系與總黃酮多酚含量間相關(guān)系數(shù)R ＞0.891，DPPH 體系與總黃酮多酚總含量間相關(guān)系數(shù)R ＞0.794，進一步表明總多酚與總黃酮是自由基清除能力的主要貢獻因素，總黃酮與多酚含量相關(guān)性較高為0.969，說明菊試樣總黃酮與多酚化合物類別有較大相似性，ABTS 與DPPH 兩種抗氧化活性測定方法間存在較高相關(guān)性，可能與其具有相似的反應(yīng)機理有關(guān)［9］。

圖4 供試菊樣醇提液自由基清除能力與總多酚和總黃酮含量相關(guān)性［(ABTS，A)，(DPPH，B)］，總多酚與總黃酮含量間(C)，ABTS 與DPPH 兩種檢測方法間(D)相關(guān)性Fig.4 Correlations between radical scavenging capacities and total flavonoids/polyphenols contents ［(ABTS，A)and (DPPH，B)］，between total flavonoids and polyphenols content assays(C)and between DPPH and ABTS assays(D)

表3 活性物質(zhì)與抗氧化方法間的相關(guān)性Table 3 Correlation coefficient (R)between active substances and radical scavenging capacity assays

4 結(jié)論

本文采用國際常用的ABTS 和DPPH 方法評價太行菊和野菊不同器官醇提液的抗氧化活性，研究其相應(yīng)的紫外-可見光譜特性，總多酚與總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性。結(jié)果表明，太行菊和野菊不同器官醇提液均有一定的抗氧化能力，其不同溫度醇提液的紫外-可見吸收峰峰形符合黃酮多酚類物質(zhì)的吸收特性。不同提取溫度的醇提液在兩種抗氧化評價體系活性順序趨勢一致，即太行菊葉＞野菊葉＞太行菊花＞太行菊莖≈野菊花＞野菊莖，且這一順序與總黃酮與多酚含量測定結(jié)果及紫外-可見吸收光譜峰值大小順序基本一致。相關(guān)性分析結(jié)果表明，總多酚與總黃酮含量與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)，進一步說明總多酚與總黃酮為菊試樣醇提液清除自由基能力的主要貢獻因素。上述研究結(jié)果初步佐證太行山區(qū)當(dāng)?shù)厝罕姺从车膶嵱眯Ч^其近緣屬的傳統(tǒng)藥用野菊，太行菊可能具有更好的保健與藥用功效，其整個植株的開發(fā)利用潛力顯著。此外，黃酮多酚類化合物不是菊試樣僅有的抗氧化活性物質(zhì)，且其種類和結(jié)構(gòu)存在多樣性，為實現(xiàn)合理開發(fā)利用，太行菊活性成分的深入研究有待繼續(xù)開展。

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