金櫻子總黃酮體外抗氧化活性的研究

文紅波，曹運(yùn)長(zhǎng)，吳玉蘭，張秋菊，冷超群

南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，生化與分子生物學(xué)教研室，衡陽(yáng) 421001

金櫻子又名糖桔子、蜂糖罐、刺梨子、山石榴等，屬薔薇科薔微屬，其成熟果實(shí)可以入藥［1］。通過對(duì)金櫻子果實(shí)的化學(xué)成分分析表明其主要的藥效成分有維生素、氨基酸、多糖，黃酮類物質(zhì)、三萜類及其衍生物［2］。目前對(duì)金櫻子多糖的藥效研究已有報(bào)道，如趙云濤等［3］提取金櫻子多糖進(jìn)行動(dòng)物小鼠試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)金櫻子多糖能顯著清除超氧陰離子自由基、抑制羥自由基，有顯著的抗氧化作用。而對(duì)金櫻子另一重要的藥效成分黃酮類化合物的研究較少，黃云祥等［4］通過高效色譜法分析了金櫻子黃酮化合物中分別含槲皮素、山萘酚、木犀草素、芹菜素等成分;陳乃富等［5］從金櫻子中分離得到了黃酮類物質(zhì)，并以亞油酸為底物，初步測(cè)定金櫻子黃酮類化合物的抗氧化能力。但對(duì)金櫻子黃酮化合物系統(tǒng)的體外抗氧化作用、藥效研究還未見報(bào)道。本研究分析評(píng)價(jià)了金櫻子總黃酮體外直接清除自由基的能力，并利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，用過氧化氫誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷，研究金櫻子總黃酮對(duì)HUVEC 抗氧化作用的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

HUVEC 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所上海細(xì)胞庫(kù);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶干粉購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青;MTT 購(gòu)自AMRESCO 公司;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Shell-lab 公司;倒置顯微鏡，日本Nikon 公司;倒置顯熒光顯微鏡，日本Olympus公司;酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek 公司;UV2450 紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 金櫻子黃酮類化合物的制備

以乙醇為溶劑浸提法提取金櫻子總黃酮(Rosa laevigata Michx total flavonoids，RLTF)，優(yōu)化的提取條件為:乙醇濃度40%、水浴溫度90 ℃、固液比1∶20，浸提時(shí)間2 h。以蘆丁為對(duì)照品，采用分光光度法對(duì)RLTF 進(jìn)行定量。RLTF 干預(yù)處理細(xì)胞時(shí)過濾除菌，臨用前用DMEM 培養(yǎng)液配成不同濃度。

2.2 RLTF 對(duì)、·OH、DPPH·自由基體外清除作用的測(cè)定

2.3 HUVEC 的培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，給予換液;待細(xì)胞融合至70%，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，按1∶3 或1∶4 傳代。

2.4 Hoechst33258 染色觀察細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞以2 ×104個(gè)/mL 接種在6 孔培養(yǎng)板中，每孔2.5 mL。待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)板70%時(shí)，加入含1%血清的DMEM 培養(yǎng)液同步12 h。實(shí)驗(yàn)分組為:(1)正常組;(2)200 μmol/L H2O2處理組;(3)400 μmol/L H2O2處理組;(4)600 μmol/L H2O2處理組;(5)800 μmol/L H2O2處理組;(6)1000 μmol/L H2O2處理組;(7)RLTF +600 μmol/L H2O2處理組;(8)RLTF+800 μmol/L H2O2處理組。第(7)與第(8)組先用0.24 mg/mL RLTF 預(yù)處理24 h 后再用相應(yīng)濃度的H2O2處理24 h。將原培養(yǎng)液吸干，每孔加1 mL 4%多聚甲醛于4℃固定20 min，固定完用PBS 洗3 次，每次5 min;每孔加1 mL 染色液于37℃染色20 min;染色后用PBS 洗3 次，每次5 min。熒光顯微鏡觀察拍照。

2.5 MTT 法檢測(cè)RLTF 對(duì)細(xì)胞活力的影響

將細(xì)胞以2 ×104個(gè)/mL 的密度接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL;待細(xì)胞融合率為70%時(shí)，加入含1%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h;根據(jù)細(xì)胞存活率確定600 μmol/L H2O2作用細(xì)胞24 h為施加條件［7］。實(shí)驗(yàn)分組為:(1)正常組;(2)H2O2損傷組:加600 μmol/L H2O2處理24 h;(3)Vc 陽(yáng)性對(duì)照組:0.2 mg/ml Vc 預(yù)處理24 h，再加600 μmol/L H2O2處理24 h;(4)RLTF 處理組:以0.12 mg/mL、0.24 mg/mL、0.48 mg/mL RLTF 預(yù)處理24 h后，再加600 μmol/L H2O2處理24 h。各組細(xì)胞每孔均加入20 μL MTT 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，各組細(xì)胞每孔加入150 μL DMSO;放入搖床搖10 min，充分反應(yīng)，酶標(biāo)儀490 nm 處測(cè)吸光值(OD)。

2.6 細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px 酶活性測(cè)定

按2.5 分組要求處理后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，隨后4 ℃，12000 rpm 離心10 min。取上清按照試劑盒說明測(cè)定各組細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px 活性。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 RLTF 對(duì)、·OH、DPPH·的清除作用

結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)表明:在20～200 μg 范圍內(nèi)，隨著待測(cè)樣品加入量的增大，RLTF 和Vc 對(duì)O-·2 的清除作用先增大后減小;蘆丁對(duì)的清除作用則隨著加入量的增大而逐漸減小;與蘆丁和Vc 比較，RLTF 對(duì)O-·2 的清除作用偏低。隨著待測(cè)溶液加入量的增大，RLTF 和Vc 對(duì)·OH 的清除作用逐漸增大，蘆丁對(duì)·OH 的清除作用則先增大后減小，RLTF對(duì)·OH 的清除能力與蘆丁相當(dāng)。RLTF、蘆丁和Vc對(duì)DPPH·的清除能力隨著加入量的增加而逐漸增強(qiáng)，RLTF 對(duì)DPPH·的清除率強(qiáng)于蘆丁，但Vc 對(duì)DPPH·的清除能力要遠(yuǎn)高于RLTF 和蘆丁。

圖1 RLTF 對(duì)(A)、·OH(B)、DPPH·(C)的清除作用Fig.1 Scavenging capacities of RLTF on superoxide anion (A)，·OH (B)and DPPH· (C)

3.2 Hoechst 33258 染色觀察細(xì)胞凋亡

經(jīng)Hoechst33258 染色后，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈現(xiàn)正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核則會(huì)呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)亮。如圖2 所示，正常組HUVEC 細(xì)胞呈淺藍(lán)色熒光，淺染;200 μmol/L H2O2損傷組細(xì)胞有幾個(gè)強(qiáng)度很亮的藍(lán)色亮點(diǎn)(即凋亡小體，箭頭所示);400、600 μmol/L H2O2損傷組與正常組比較細(xì)胞數(shù)量開始減少，部分細(xì)胞的核呈致密濃染，且藍(lán)色亮點(diǎn)數(shù)目逐漸增多。800、1000 μmol/L H2O2損傷組與正常組相比細(xì)胞數(shù)目顯著減少，且有大量高強(qiáng)度藍(lán)色亮點(diǎn)。經(jīng)過RLTF 預(yù)處理24 h 后的600、800 μmol/L H2O2損傷組與600、800 μmol/L H2O2損傷組比較，細(xì)胞數(shù)目雖都表現(xiàn)明顯較少，但高強(qiáng)度藍(lán)色亮點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)比未經(jīng)RLTF 預(yù)處理的要少，表明RLTF 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，減少了H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷，增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞的抗凋亡作用。

3.3 RLTF 對(duì)HUVEC 細(xì)胞活力的影響

從表1 可看出，用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后，細(xì)胞活力顯著降低，正常細(xì)胞組與Vc 陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞活力均高于H2O2損傷組。不同濃度RLTF 預(yù)處理組與H2O2損傷組比較，各組細(xì)胞活力均高于H2O2損傷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01=，且隨著RLTF 濃度的增加，細(xì)胞的活力逐漸增大。

3.4 RLTF 對(duì)受損內(nèi)皮細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px 酶活力的影響

圖2 不同處理組凋亡細(xì)胞形態(tài)(Hoechst33258 染色，×100)Fig.2 The apoptosis cell morphology of different treatment groups (Hoechst33258 staining，×100)

表1 RLTF 對(duì)氧化損傷HUVEC 細(xì)胞活力的影響Table 1 Effect of RLTF on the viability of HUVECs injured by hydrogen peroxide

結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后，細(xì)胞內(nèi)的SOD、CAT、GSH-Px 酶活性與正常組比較顯著降低(P＜0.01)。與H2O2損傷組比較，不同濃度的RLTF 預(yù)處理組細(xì)胞中的SOD、CAT、GSH-Px 酶活性均出現(xiàn)升高，除0.12 mg/mL RLTF處理組細(xì)胞SOD 活性與H2O2損傷組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組與H2O2損傷組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。且隨著RLTF 濃度的增大，三種酶活性呈劑量依賴性的升高。

表2 RLTF 對(duì)氧化損傷HUVEC 中SOD、CAT、GSH-Px 活性的影響Table 2 Effect of RLTF on SOD，CAT and GSH-Px activity of HUVECs injured by hydrogen peroxide

4 分析與討論

自由基是人體在進(jìn)行生命活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的一種活性分子，自由基的生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡之中。如果自由基產(chǎn)生過多或未及時(shí)清除會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基的積累，其會(huì)嚴(yán)重?fù)p害生物膜、核酸、蛋白質(zhì)、酶及活細(xì)胞的功能，繼而導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損傷、誘發(fā)各種疾病、加速機(jī)體衰老。目前研究表明許多心血管疾病或炎癥，都與自由基有關(guān)，如細(xì)胞內(nèi)的過量的自由基會(huì)導(dǎo)致低密度脂蛋白(LDL)過氧化成為ox-LDL，過量的ox-LDL 被巨噬細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞并黏附在血管內(nèi)壁，而后發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化。因此人工化學(xué)合成或?qū)ふ姨烊坏目寡趸瘎?duì)預(yù)防和治療心血管疾病具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。目前人們先后從植物中提取了許多具有自由基清除能力的天然產(chǎn)物，其中黃酮類化合物是活性較強(qiáng)的一類。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金櫻子總黃酮體外對(duì)·OH 自由基、DPPH·自由基具有較強(qiáng)的直接清除作用，但對(duì)自由基的直接清除能力較弱。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷在多種心血管疾病發(fā)生和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，而活性氧則是眾多誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的原因之一［8］。活性氧過氧化氫對(duì)細(xì)胞的損傷作用近年來一直是研究的熱點(diǎn)。有研究表明過氧化氫能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)將內(nèi)皮細(xì)胞暴露于適度低濃度H2O2時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡［9］。本研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度的H2O2處理組，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞存活率也有所下降，少數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染，隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞存活率顯著下降，核出現(xiàn)致密濃染的比例明顯增高，當(dāng)H2O2達(dá)到1000 μmol/L 時(shí)，幾乎所有細(xì)胞出現(xiàn)核致密濃染，同時(shí)大部分細(xì)胞已壞死或凋亡。而經(jīng)過金櫻子總黃酮預(yù)處理之后的細(xì)胞其抗凋亡能力在一定程度上得到增強(qiáng)，并能有效提高細(xì)胞的存活率。機(jī)體對(duì)自由基的清除主要是通過體內(nèi)的抗氧化酶系，已有研究證實(shí)黃酮類化合物能提高機(jī)體的抗氧化酶活性［10］。本研究中過氧化氫損傷組與正常組比較，細(xì)胞內(nèi)的SOD、CAT、GSH-Px 三種酶的活性均有所下降，但經(jīng)過不同濃度的金櫻子總黃酮預(yù)處理之后，三種抗氧化酶的活性顯著升高，表明金櫻子總黃酮能明顯提高細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px 酶活力。

金櫻子果肉中黃酮含量較高，其所含有的黃酮類化合物是具有很大開發(fā)價(jià)值的天然抗氧化劑。金櫻子總黃酮對(duì)氧化損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，其抗氧化機(jī)制可能通過直接清除自由基，抑制細(xì)胞凋亡，提高體內(nèi)抗氧化酶活性有關(guān)，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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