白蕓豆球蛋白的提取及其氨基酸組成研究

訾 艷，王常青，黨彥飛，陳 源，黃宜穎，李雯娟

山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006

白蕓豆(white kidney bean)，生物學(xué)名菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.)，別名四季豆、白腰豆等，在我國(guó)西南地區(qū)種植面積較大。白蕓豆中蛋白質(zhì)含量19.9%～20.0%，脂肪含量1.6%～2.1%，碳水化合物含量37.6%～48.5%，并含有豐富的Ca、Fe、維生素C、維生素B1、維生素B2等維生素［1］;有研究表明，白蕓豆分離蛋白中必需氨基酸含量為41.34%，氨基酸評(píng)分為91.25［2］，由此可見(jiàn)，白蕓豆是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的豆類食品。但是，目前未見(jiàn)有關(guān)白蕓豆中球蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究報(bào)道。本課題研究表明，白蕓豆中含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中清蛋白含量最高(此文另發(fā))。白蕓豆清蛋白中含有一種天然的α-淀粉酶抑制劑，可以用于治療肥胖癥和糖尿病等［3］。而提取清蛋白后所剩白蕓豆殘?jiān)泻写罅壳虻鞍祝瑸槌浞掷冒资|豆蛋白資源，本文研究了白蕓豆球蛋白的提取工藝，并對(duì)球蛋白的分子量和氨基酸組成進(jìn)行了比較分析，旨在為白蕓豆蛋白資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

白蕓豆(購(gòu)于云南銀健食品有限公司);白蕓豆分離蛋白(本實(shí)驗(yàn)室采用堿溶酸沉法［4］制備);蛋白質(zhì)電泳Marker(北京天恩澤基因科技有限公司);其他試劑(為國(guó)產(chǎn)分析純)。

DYCZ-23A 型電泳儀(北京市六一儀器廠);數(shù)顯恒溫水浴提取器(國(guó)華電器有限公司);UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)［尤尼科(上海)儀器有限公司］;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申升科技有限公司);pH 計(jì)(奧立龍);Thermo MR23 冷凍離心機(jī)(美國(guó)熱電公司);日立835-50 型高速氨基酸分析儀(日本日立公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 白蕓豆球蛋白的提取試驗(yàn)

白蕓豆烘干粉碎后過(guò)60 目篩，按1∶10 加入蒸餾水，在40 ℃提取2 次，每次2 h，提取后離心，棄去上清液，取沉淀干燥，作為球蛋白提取試驗(yàn)的原料。球蛋白提取單因素試驗(yàn)包括不同料液比(1 ∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)、不同NaCl 濃度(0.5、1、2、3、4、5 g/100 mL)、不同溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)和不同時(shí)間(1、2、3、4、5、6h)的提取試驗(yàn)。以上不同條件下的球蛋白提取液經(jīng)4000 rpm離心20 min 取上清液，測(cè)定上清液中的蛋白含量，按下式計(jì)算球蛋白提取率:球蛋白提取率(%)=離心上清液中蛋白質(zhì)含量×100/白蕓豆中總蛋白質(zhì)含量;其中上清液中蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法［5］測(cè)定，白蕓豆中總蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5-2010 測(cè)定。

在以上單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取工藝參數(shù)，進(jìn)行球蛋白提取的正交試驗(yàn)。

2.2 白蕓豆球蛋白的硫酸銨鹽析試驗(yàn)［6］

取上一步中提取的球蛋白溶液8 等份，加入硫酸銨，分別達(dá)到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的飽和度，4 ℃靜置1 h，離心收集上清液，測(cè)定未沉淀蛋白含量，按下式計(jì)算球蛋白的鹽析得率:鹽析得率(%)=(球蛋白溶液中總蛋白質(zhì)量-未沉淀蛋白質(zhì)量)×100/球蛋白溶液中總蛋白質(zhì)量。再取4 等份球蛋白溶液，按球蛋白鹽析得率最大的飽和度加入硫酸銨，在4 ℃下研究不同鹽析時(shí)間(0.5、1、1.5 和2 h)對(duì)球蛋白鹽析得率的影響。鹽析沉淀物透析48 h，冷凍干燥后得鹽析后的球蛋白。

2.3 白蕓豆球蛋白和分離蛋白的分子量測(cè)定

采用SDS-PAGE 凝膠電泳法確定白蕓豆球蛋白和分離蛋白的分子量。分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%。考馬斯亮藍(lán)R-250 染色。將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)對(duì)其相對(duì)遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算球蛋白和分離蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。

2.4 白蕓豆球蛋白的氨基酸組成分析［7］

取樣品20 mg 加入6 mol/L HCl 沖入氮?dú)夥饪冢?10 ℃烘箱內(nèi)水解22 h，冷卻搖勻過(guò)濾，雙蒸水定容至50 mL，取1 mL 凍干后加入0.02 mol/LHCl 搖勻，14000 rpm 離心15 min，吸取上清液0.8 mL 過(guò)0.45 μm 濾膜，用日立835-50 氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 白蕓豆球蛋白提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 NaCl 濃度對(duì)白蕓豆球蛋白提取率的影響

在料液比1∶10，40 ℃提取2 h 的條件下，NaCl濃度小于2 g/100 mL 時(shí)，白蕓豆球蛋白提取率隨著NaCl 濃度增加而顯著增大，在2 g/100 mL 時(shí)提取率達(dá)到最大值;之后隨著NaCl 濃度增加提取率呈下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖1A)。這可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液中有較多中性鹽時(shí)，會(huì)降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的相互作用，使水化膜破壞;同時(shí)，蛋白質(zhì)分子間的疏水性作用增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低［8］。因此，正交試驗(yàn)中NaCl 濃度選1.5、2 和2.5 g/100 mL。

3.1.2 料液比對(duì)白蕓豆球蛋白提取率的影響

以2 g/100 mL 的NaCl 溶液，在40 ℃提取2 h，料液比與球蛋白提取率的關(guān)系見(jiàn)圖1B。料液比1∶20 時(shí)，白蕓豆球蛋白提取率最大，高于和低于1∶20時(shí)，提取率均會(huì)下降。料液比降低不利于球蛋白的溶出，但過(guò)高的料液比可能增加原料中非蛋白物質(zhì)的溶出。因此，正交試驗(yàn)中料液比選在1∶18、1∶20和1∶22。

3.1.3 提取溫度對(duì)白蕓豆球蛋白提取率的影響

用2 g/100 mL 的NaCl 溶液，料液比1∶10，提取2 h，得到提取溫度與球蛋白提取率的關(guān)系(圖1C)。在60 ℃之前，提取率隨提取溫度的升高而增大，60℃時(shí)達(dá)到最大值;60 ℃之后，隨提取溫度的升高，球蛋白提取率迅速下降。有報(bào)道稱，蕓豆淀粉起糊溫度在70 ℃左右［9］，因此提取溫度高于70 ℃后，淀粉的糊化會(huì)阻礙蛋白質(zhì)的溶出，從而降低了蛋白質(zhì)的提取率。因此，下一步正交試驗(yàn)中溫度選在55、60和65 ℃。

圖1 NaCl 濃度(A)、料液比(B)及提取溫度(C)對(duì)球蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of concentration of NaCI (A)，solid-liquid ratio (B)and extraction temperature (C)on extraction yield of globulin

3.2 白蕓豆球蛋白提取正交試驗(yàn)結(jié)果

以NaCl 濃度、料液比和提取溫度的單因素試驗(yàn)結(jié)果及提取時(shí)間的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(提取5 h 時(shí)球蛋白提取率最高)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)白蕓豆球蛋白提取的L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 白蕓豆球蛋白提取的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of orthogonal experiment of extraction of white kidney bean globulin

表2 白蕓豆球蛋白提取的正交試驗(yàn)方差分析表Table 2 Analysis of variance of extraction of white kidney bean globulin

正交試驗(yàn)表明，白蕓豆球蛋白的最佳提取工藝參數(shù)組合為A3B3C1D2，即NaCl 濃度2.5 g/100 mL，料液比1∶22，提取溫度55 ℃，提取時(shí)間5 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，球蛋白提取率的平均值為31.46%，高于正交表中其他組合，證明正交試驗(yàn)可靠。影響白蕓豆球蛋白提取率的因素為A ＞B ＞C＞D，即NaCl 濃度對(duì)球蛋白提取率的影響最大，料液比次之，提取時(shí)間的影響最小。方差分析也表明，NaCl 濃度對(duì)白蕓豆球蛋白提取率的影響極顯著(P＜0.01)，料液比影響顯著(P＜0.05)，而提取溫度和時(shí)間的影響不顯著。

圖2 白蕓豆球蛋白硫酸銨鹽析濃度曲線Fig.2 Ammonium sulphate salting-out curve of white kidney bean globulin

3.3 白蕓豆球蛋白的硫酸銨鹽析

由圖2 可知，隨著硫酸銨飽和度增加，球蛋白鹽析得率不斷增加，當(dāng)硫酸銨飽和度為60%時(shí)，鹽析得率最大，再增大硫酸銨的飽和度，鹽析得率基本不變。在鹽析時(shí)間試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在4 ℃時(shí)，用60%的硫酸銨鹽析球蛋白0.5、1、1.5 和2 h 的鹽析得率變化很小。最終選擇球蛋白鹽析的條件為:在4 ℃下，用60%的硫酸銨鹽析1 h，在此條件下，球蛋白鹽析得率的平均值為73.55%。

3.4 白蕓豆球蛋白和分離蛋白分子量的電泳分析

由白蕓豆球蛋白和分離蛋白的電泳圖譜可知，球蛋白共分離出6 條蛋白亞基條帶，分離蛋白共分離出8 條蛋白亞基條帶(這與張丙云［2］等人的研究結(jié)果一致)。將球蛋白和分離蛋白各亞基的相對(duì)遷移率帶入蛋白質(zhì)Marker 標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算出球蛋白各亞基相對(duì)分子質(zhì)量()由大到小分別為97.52 ±0.72、47.35 ±0.49、33.84 ±0.38、29.62 ±0.31、26.28 ±0.28 和21.99 ±0.19ku，分離蛋白各亞基相對(duì)分子質(zhì)量分別為79.95 ±0.81、60.11 ±0.52、55.47 ±0.47、47.30 ±0.41、33.89 ±0.38、29.68 ±0.33、26.24 ±0.21 和21.97 ±0.16ku。可見(jiàn)，白蕓豆分離蛋白和球蛋白共有5 條蛋白亞基條帶相吻合，說(shuō)明白蕓豆分離蛋白中的主要成分是球蛋白。

圖3 白蕓豆球蛋白和分離蛋白SDS-PAGE 圖譜Fig.3 SDS-PAGE electrophoretogram of white kidney bean globulin and isolated protein

3.5 白蕓豆球蛋白的氨基酸組成分析

由表3 可知，白蕓豆球蛋白中含有18 種氨基酸(色氨酸因樣品處理采用酸水解未檢出)，氨基酸總量達(dá)76.56%，其中谷氨酸和天冬氨酸含量最高，分別為11.51% 和9.59%，而蛋氨酸含量最低，為1.33%。球蛋白中人體必需的8 種氨基酸總量為30.91%，與總氨基酸的比值(EAA/TAA)為40.37%，這與FAO/WHO 提出的EAA/TAA 為40%左右的參考蛋白模式相近，說(shuō)明球蛋白屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。從表4 比較分析可知，白蕓豆分離蛋白的第一、第二限制性氨基酸分別為異亮氨酸和蘇氨酸，而球蛋白分別為蘇氨酸和異亮氨酸。球蛋白的AAS 為83.50，與標(biāo)準(zhǔn)模式接近。與其他植物蛋白不同的是，賴氨酸不是白蕓豆球蛋白的第一限制性氨基酸。此外，球蛋白中苯丙氨酸+酪氨酸含量遠(yuǎn)高于FAO/WHO 模式推薦值。可見(jiàn)白蕓豆球蛋白必需氨基酸比例均衡，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。

表3 白蕓豆球蛋白氨基酸組成與含量(g/100 g)Table 3 Amino acid composition and content of white kidney bean globulin (g/100 g)

表4 白蕓豆球蛋白的必需氨基酸組成及氨基酸評(píng)分(g/100 g)Table 4 Essential amino acid composition and amino acid score of white kidney bean globulin (g/100 g)

4 結(jié)論

白蕓豆球蛋白最佳提取條件為NaCl 濃度2.5 g/100 mL，料液比1 ∶22(g/mL)，溫度55 ℃，時(shí)間5h，此時(shí)球蛋白提取率為31.46%。用60%的硫酸銨，在4 ℃下鹽析1 h，球蛋白的鹽析得率為73.55%。白蕓豆球蛋白電泳分離出的6個(gè)蛋白亞基條帶中，有5 條與分離蛋白的電泳條帶相同，分離蛋白中只有79.95、60.11 和55.47 ku 這3個(gè)亞基在球蛋白中沒(méi)有。白蕓豆球蛋白的氨基酸組成種類齊全，必需氨基酸含量接近FAO/WHO 推薦模式，是較好的植物蛋白質(zhì)資源。

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