微小RNA 前體區域基因多態與兒童特異性皮炎易感性的關聯研究*

蘇潔慧，李群山，劉麗芬，包永芬

(1.惠州市中醫醫院，廣東 惠州 516001;2.湖北科技學院基礎醫學院)

特異性皮炎(atopic dermatitis，AD)是多發于嬰幼兒的一種慢性、復發性、炎癥性皮膚疾病，主要臨床表現為皮膚廣泛紅斑、丘疹、脫屑、頑固瘙癢和皮膚干燥等。流行病學研究顯示過去30 年中世界大多數工業化國家兒童AD 的患病率大幅度增加，不僅給患兒的生長發育和心理健康造成極大影響，也給家庭和社會帶來了經濟負擔［1］。AD 的病因尚不完全清楚，有研究認為炎性免疫機制中T 細胞因子失衡在AD 的發生和發展中起著非常重要的作用［2］。微小RNA(micro-RNA，miRNA)是一類高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，其參與調控細胞生長、發育、分化和增殖等多個生命過程［3］，包括參與了免疫細胞的分化和成熟、抗體的產生、炎性因子的釋放等免疫過程，對機體免疫功能的正常發揮起著非常重要的作用［4］，而miRNA 相關單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)可以調控miRNA 的表達和功能［5］。目前研究較多的miRNA 前體區域基因多態SNPs 是hsa-mir-149 rs2292832、hsa-mir-146a rs2910164、has-mir-499 rs374644 和hsa-mir-196a2 rs11614913，已有多個研究顯示這些SNPs 與腫瘤、哮喘和呼吸系統疾病的發病風險存在著關聯［6］，但其與兒童AD 易感性的相關研究未見報道。本研究擬采用病例-對照研究，探討此4 個SNPs 與兒童AD 易感性的關系，為進一步闡明兒童AD 的發病機制奠定基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2004 年9 月至2012 年3 月，在惠州市某三甲醫院收集本研究所需的研究對象。病例是在該醫院兒科就診的符合Hanifin 和Rajka 診斷標準的AD 患兒，且2 周內未使用糖皮質激素和3d 內停用抗組胺類藥物。對照組為同期在該醫院體檢合格的健康兒童400例，無蕁麻疹、濕疹和哮喘等過敏性疾病史且血液學分析、生化和免疫等檢測結果均正常，并與病例組按年齡(相差不超過1 個月)進行1∶1 匹配，搜集符合條件的病例和對照各400例。所有研究對象均簽署知情同意書，并在調查員指導下，由研究對象的監護人填寫統一的調查表，調查內容包括基本人口學信息、香煙暴露史和過敏性疾病家族史等資料。研究對象均空腹抽取外周血2～3ml，肝素抗凝，于-80℃冰箱保存。

1.2 基因型分析

共選取hsa-mir-149 rs2292832、hsa-mir-146a rs2910164、has-mir-499 rs374644 和hsa-mir-196a2 rs11614913，4 個SNPs 進行分析。探針和引物均從ABI 公司訂購，并按照說明配制PCR 反應體系，采用ABI 公司的7900HT 型高通量實時熒光定量PCR 系統(兼容96 孔、384 孔和Tagman 低密度表達譜芯片)進行PCR 反應和終點讀板分析。利用SDS2.2.1 軟件分析基因分型結果。每一個384 孔板均設置3 個陽性對照，采用質量好的DNA 樣本;3 個陰性對照采用DNA 稀釋液代替基因組DNA 加入PCR 反應體系中。每板均采用質量控制樣本重復檢測，檢測結果一致性為100%。

1.3 統計學方法

以χ2檢驗和t 檢驗比較病例組和對照組之間的人口學特征和基因型的分布差異。對照組的基因型分布進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗采用擬合優度χ2檢驗;單因素和多因素logistic 回歸計算OR 值及其95%CI。所有的統計學檢驗均為雙側概率檢驗，檢驗水準為α=0.05。所有統計分析均使用SPSS18.0 軟件包進行。

2 結果

2.1 一般情況

兩組一般情況比較見表1，可見病例組男性比例顯著高于對照組(P ＜0.01)，病例組有過敏性疾病家庭史患者比例也顯著高于對照組(P ＜0.01)。

表1 AD 患兒和健康對照兒童的一般情況()

表1 AD 患兒和健康對照兒童的一般情況()

與對照組比較，* P ＜0.01

2.2 微小RNA 前體區域SNPs 和兒童AD 的關聯性

擬合優 度 χ2檢驗顯 示 hsa-mir-149 rs2292832、hsa-mir-146a rs2910164、has-mir-499 rs374644 和hsa-mir-196a2 rs11614913，4 個SNP 在對照組中的基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡規律(P ＞0.05)。表2 為各SNPs 基因型在病例組和對照組中的頻率分布。調整性別、年齡、家庭環境香煙暴露史和過敏性疾病家族史等變量后，多因素Logistic 回歸分析顯示:與hsa-mir-146a rs2910164 基因型為GG+CG 者相比，基因型為CC 者患AD 的危險性增加(OR=1.49，95%CI:1.21-1.85，P ＜0.001);未發現 hsa-mir-196a2 rs11614913、hsa-mir-149 rs2292832 和has-mir-499 rs374644，3 個位點的基因型在病例組和對照組的頻率分布的統計學差異(P ＞0.05)。

表2 微小RNA 前體區域基因型頻率分布以及與兒童AD 危險度的關系

2.3 hsa-mir-146a rs2910164 位點基因頻率與兒童AD 發病風險的分層分析

按性別、家庭環境香煙暴露史和過敏性疾病家族史進行分層，采用多因素Logistic 回歸分析，校正混雜因素后發現，攜帶CC 基因型增加AD 發病風險在男性(OR=1.60，95%CI:1.24-2.02，P＜0.001)、有家庭環境香煙暴露史(OR=2.00，95%CI:1.75-2.34，P ＜0.001)和無過敏性疾病家族史(OR=1.45，95%CI:1.11-1.85，P=0.011)的兒童中更加顯著，結果見表3。

表3 rs11614913 位點基因頻率與兒童AD 發病風險的分層分析

3 討論

miRNA 是一類長21～24 個核苷酸的高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，通過降解mRNA 或者抑制蛋白質的翻譯過程，從轉錄后水平實現對靶基因的調控，從而參與細胞生長、發育、分化和增殖等多個生命過程［3］。近年來，有多個研究顯示miRNA 功能與腫瘤、神經系統疾病哮喘有著密切的關系［7］。miRNA 前體區域的SNPs 可能影響其表達、成熟以及與靶mRNA 的結合，如研究表明hsa-mir-146a rs2910164 C 等位基因可顯著增加成熟 miRNA-146a 的形成［8］;hsa-mir-196a2 rs11614913 C 等位基因則會影響miRNA-196a2 的成熟過程以及與靶mRNA 的結合能力［9］。Xu Zhibin 等用NCBI dbSNP 數據庫對miRBase 中注冊的miRNAs 進行了序列比對，發現中國人群中miRNA 前體區域高度保守，有潛在功能的SNPs僅有4 個，分別為hsa-mir-149 rs2292832、hsa-mir-146a rs2910164、has-mir-499 rs374644 和hsa-mir-196a2 rs11614913［9］，他們還報道hsa-mir-196a2 rs11614913 C 等位基因可顯著增加肺癌的發病風險，且與非小細胞肺癌的不良預后顯著相關［10］。目前在中國人群中主要是研究此4 個miRNA 前體區域SNPs 與腫瘤的關系，其與其它疾病的關系鮮有報道。

本病例-對照研究首次探討了miRNA 前體區域4 個常見潛在功能位點與中國兒童AD 易感性的關系。結果顯示hsa-mir-146a 基因多態性位點rs2910164 與兒童AD 易感性有關;未發現其它3個SNPs 與AD 易感性有關。以往研究發現hsamir-146a rs2910164 C 等位基因可顯著增加成熟miRNA-146 水平，另外功能學實驗表明成熟的miRNA-146 通過TNF-α 途徑影響IL-8 和CCL5/RANTES 等炎性因子的釋放參與機體炎性免疫反應［11］，提示rs2910164 CC 基因可能通過影響成熟miRNA-146 水平，從而調節機體炎性免疫反應而使兒童AD 的發病風險增加。分層分析顯示，rs2910164 CC 基因型增加兒童AD 發病風險。在男性、有家庭環境香煙暴露史和無過敏性疾病家族史的兒童中更加顯著。有家庭環境香煙暴露史的兒童rs2910164 CC 基因型增加AD 發病風險更加顯著，提示rs2910164 CC 基因型與香煙暴露在促進兒童皮膚炎性免疫反應中存在協同作用。在有過敏性疾病家族史的患兒中rs2910164 CC 基因型效應不明顯，可能是由于過敏性疾病家族史是兒童AD 較強的危險因素，掩蓋了rs2910164 CC基因型的效應。

綜上，miRNA 前體區域hsa-mir-146a 基因多態性位點rs2910164 CC 基因型可顯著增加兒童AD 發病風險，但該結果還需在其他地區人群中擴大樣本量進行重復、驗證，rs2910164 CC 基因型增加兒童AD 發病風險的機制尚有待進一步功能學探索。

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