不同激素組合對唐古特大黃愈傷組織的影響

哈斯其美格， 曹 忻， 李海玲， 張 洋

(1. 西北民族大學 實驗中心，甘肅 蘭州730030;2. 雙澤管理咨詢公司，山東 濟南250000)

大黃作為我國特產的傳統中藥材，始載于《神農本草經》，名為“將軍”，《中國藥典》收載為蓼科大黃屬植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根及根莖。前兩種主產于青海、甘肅，習稱北大黃，品種較優，后一種主產于四川，習稱南大黃。民間根莖入藥，味苦性寒，具有“瀉下攻積、清熱瀉火、止血、解毒、活血化瘀”之功效［1-3］。

唐古特大黃，分布于青藏高原，是一種常用藏藥，又稱“雞爪大黃”，是青海省重要的特色藥物資源之一，產量大，品質優，在國內外享有盛譽。目前，唐古特大黃資源一直依賴野生植物的采收，由于得不到有效的保護，導致野生大黃資源日益減少、近于枯竭。通過組織培養技術人工繁殖大黃，既可保護野生資源，又可滿足日益增長的市場需求［4-6］。本實驗選用唐古特大黃種子萌發的無菌苗為材料，對唐古特大黃中蒽醌類次生代謝物質的生物合成途徑進行了初步探索，研究了不同激素對唐古特大黃愈傷組織的影響，以便為唐古特大黃中蒽醌物質生物合成途徑的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim. ex Regel.)，采于青海省黃南藏族自治州澤庫縣。

1.2 儀器 手提式壓力蒸氣消毒器YX-280B 型(江陰濱江醫療設備廠);DELTA320pH 計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);WGP-350 隔水式電熱恒溫培養箱(上海安亭科學儀器廠);S.HS-1300 水平送風凈化工作臺(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 愈傷組織的誘導 取唐古特大黃飽滿粒大的種子，在水中浸泡10 h，將種皮剝去。在超凈工作臺上，將種子先用75%乙醇溶液浸泡45 s，再用0.1%的HgCl2浸泡15 min，然后用無菌水清洗5 遍。將種子剝開，取出胚，將其接種到MS 固體培養基表面上。在25 ℃左右，于培養箱內恒溫培養。培養約3 周后，即可誘導出愈傷組織。

1.3.2 生長培養基的選擇 以MS 為基本培養基，向培養基中添加不同組合的激素(見表1)。本研究使用的是常用激素2，4-D、6-BA、NAA。

1.3.3 生產培養基的選擇 從不同激素組合的培養基(見表1)中培養出愈傷組織，分別測定它們的蒽醌量［4］。

表1 培養基中不同的激素組合

1.3.4 愈傷組織的繼代培養 每隔4 周時間，要對愈傷組織進行一次繼代培養，將其轉入新培養基中，并在轉接時用天平稱量愈傷組織的質量變化，以對其生長速率做出分析。

2 結果

2.1 對唐古特大黃愈傷組織誘導率的影響 外植體在接種大約一周后開始膨大，約3 周后開始形成愈傷組織。激素2，4-D 單獨存在時，2，4-D 組(1、2、3)愈傷組織誘導率分別為65.4%、73.3%和68.5%。在激素2，4-D 質量濃度一定的情況下，添加質量濃度遞增的激素6-BA 后，相對于2，4-D 組，A、B、C 組的誘導率明顯升高。但激素6-BA 的質量濃度變化對愈傷組織誘導率影響不大。在激素6-BA 質量濃度(2 mg/L)一定的情況下，觀察激素2，4-D 質量濃度變化對愈傷組織誘導率的影響，發現隨著激素2，4-D 質量濃度的增加，相對于A、B、C 組，D、E、F 組誘導率明顯升高。當激素2，4-D 質量濃度為2 mg/L 時，D 組在D、E、F三組中誘導率最高，但激素2，4-D 質量濃度超過2 mg/L后，相對于D 組，E、F 組誘導率又隨之降低。在激素2，4-D、6-BA質量濃度一定的情況下，添加另一種激素NAA，相對于D 組G、H、I 組誘導率升高，但無顯著的差距，說明生長素NAA 對誘導率的變化無顯著的影響。見表2。

表2 不同激素組合的愈傷誘導情況

2.2 對愈傷組織生長速率的影響 在半年的繼代培養時間內，每隔4 周，對愈傷組織進行一次繼代培養，將其轉入新的培養基中。每次轉接時，稱量每組愈傷組織的質量變化，用于生長速率分析。所得的數據如表3。

表3 愈傷組織的生長情況

對表3 中數據進行分析，發現G、H、I 3 組培養基的愈傷組織的生長速率是最大的(見圖1)。D、E、F 3 組的生長速率比A、B、C 3 組稍大，但無明顯差距。內部比較時，A、B、C 3 組之間基本持平，說明激素6-BA 質量濃度的變化對愈傷組織的生長速率亦無明顯效應;D、E、F 3 組之間，F 組的生長速率較其他兩組要稍大;G、H、I 3 組之間，H 組最大。而且G、H、I 3 組的愈傷誘導率也是最大的，說明H 組是愈傷組織最佳的生長培養基。

圖1 愈傷組織的生長速率

2.3 對愈傷組織中蒽醌量的影響 在不同的激素刺激下，愈傷組織顯示出不同大小的蒽醌合成能力(見圖2)。從圖中可以看出，A、B、C 3 組之間無明顯規律，相差亦不大;D、E、F 3 組的量是逐漸減少的，說明大劑量的激素2，4-D對蒽醌的合成有一定程度的抑制作用;G、H、I 3 組仍然是最高的，相差亦不大。說明H 組是愈傷組織最佳的生產培養基。

圖2 愈傷組織中的蒽醌量比較

3 討論

3.1 不同激素對愈傷組織誘導和生長的影響 激素作為植物生長調節劑，對愈傷組織的誘導有著各自獨特的作用［7-10］。本實驗中，激素2，4-D 對愈傷組織誘導起著主導性的作用。單獨使用時就有較高的誘導率，加入激素6-BA后，誘導率顯著提高。在激素6-BA 質量濃度不變的情況下，誘導率隨激素2，4-D 質量濃度變大而提高，2 mg/L 時最大，而后逐漸降低。這說明激素2，4-D 的促進誘導作用有個最適質量濃度，高于這個質量濃度，反而對愈傷誘導有抑制作用。

生長素NAA 對誘導率的影響并不是很大，可能是因為NAA 所需的作用時間太長所致，這也符合張素勤等［11-15］的研究結果。NAA 誘導非洲菊葉片愈傷組織所需時間較長，當NAA 為0.5 mg/L 時，誘導出愈傷組織需26 d。NAA 誘導得愈傷組織量少，而且生長緩慢。但在本實驗中，NAA對愈傷組織的生長速率有較大的促進作用。這可能是與加速6-BA 配合的結果。

3.2 不同激素對愈傷組織中蒽醌量的影響 本實驗中，對于愈傷組織中的蒽醌產量，激素6-BA 無明顯作用;激素2，4-D 在質量濃度為2 mg/L 時效果最好，高質量濃度有較強的抑制作用，且質量濃度越高，抑制越強;1.0 mg/L 以上質量濃度的激素NAA 對2，4-D 有增效作用。

實驗結果表明，在A、B、C、D、E、F、G、H、I 組中，H 組是唐古特大黃愈傷組織最佳的生長培養基和生產培養基。2，4-D，6-BA，NAA 3 種不同激素組合的最佳培養基是:MS +2，4-D (2 mg/L) +6-BA (2 mg/L) + NAA(1 mg/L)，在此培養基上，愈傷組織的生長速率和蒽醌的產量都有較佳的表現。

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