HPLC 法篩查中藥軟膏制劑中非法添加的17 種糖皮質激素

潘 軍

(濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濱州256618)

糖皮質激素(Glucocorticoid)是一類具有孕甾烷基本母核，通常同時具有17-α 羥基和11-氧(羥基或氧代)取代的化合物［1］。糖皮質激素與糖、脂肪、蛋白質的代謝和生長發育等有著密切的關系，還具有抑制免疫應答、抗炎、抗毒、抗休克作用。由于糖皮質激素類藥物多數具有明顯的抗炎作用，又可以透過表皮到達皮下血管發揮作用。在商業利益的驅使下，近年來出現了一些在中藥軟膏制劑中添加糖皮質激素類藥物，而在藥品說明書中卻不加以注明的非法制劑。由于糖皮質激素本身具有一些影響水、鹽代謝的副作用［2］，與其他藥物合用還會出現許多不良反應［3-6］，長期使用會對患者的身體健康造成損害［7］。

目前應用于檢測糖皮質激素類藥物的方法較多［8-12］，但國內外文獻中適合用于快速篩查的方法較少［13-14］，本實驗對17 種常見的、可能用于非法添加的糖皮質激素類藥物進行了研究，建立了可同時檢測17 種糖皮質激素類非法添加物的快速篩查方法。本方法操作簡單，可以使用混合對照品溶液，對儀器設備要求較低，適合在配置有二極管陣列檢測器HPLC 的移動快檢車內操作。適用于基層藥檢工作人員在現有條件下對市場上的中藥制劑進行篩查，對制假售假和非法添加的行為予以打擊，進一步保證人民群眾的用藥安全。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥 Agilent1260 高效液相色譜儀(四元低壓，DAD 檢測器，Chemstation C01.04 色譜工作站)，乙腈 (色譜純，TEDIA，批號1203366)，重蒸蒸餾水(自制)，甲酸(分析純，天津市博迪化工有限公司，批號121001)，對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，批號見表1。

表1 通常用于非法添加的糖皮質激素類藥物Tab.1 Common glucocorticoids adulteration in herbal ointments

1.2 色譜條件 Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);以0.1%甲酸的水溶液作為流動相A，以乙腈作為流動相B，梯度洗脫(0 ～15 min，30%B;15 ～30 min，30% ～60%B，30 ～32 min，60%B);體積流量1 mL/min;柱溫箱溫度35.0 ℃;檢測器波長范圍190 ～400 nm，帶寬4 nm;進樣量20.0 μL;分析時間為32 min;后運行時間10 min。

分別取17 種對照品溶液連續進樣5 次，17 種成分色譜峰的峰面積的RSD 均小于0.4%，保留時間RSD 均小于0.4%，17 種藥品色譜峰的理論板數均大于10 000。17 種糖皮質激素的色譜圖見圖1。結果表明精密度良好，柱效滿足分析要求。

1.3 樣品制備

1.3.1 對照品溶液的制備 分別稱取17 種糖皮質激素對照品，用乙腈-水-甲酸(30 ∶70 ∶0.1)溶解，并稀釋至含對照品10 μg/mL 的溶液，作為對照品溶液。

圖1 17 種糖皮質激素的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 17 kinds of glucocorticoids

1.3.2 供試品溶液制備 取試樣0.5 g，加乙腈-水-甲酸(30 ∶70 ∶0.1)適量，超聲10 min 使樣品溶解并定容至50 mL (若樣品難溶，可水浴中適當加熱并振搖使軟膏融化，放冷后取水相層)，0.45 μm微孔濾膜過濾，續濾液作為供試品溶液。

1.4 方法學驗證試驗

1.4.1 專屬性 本次實驗選用了華佗膏(上海松華藥業有限公司生產，批號121005)、參皇軟膏(吉林吉春制藥股份有限公司生產，批號121028)、蟹黃膚寧軟膏(山東明仁福瑞達制藥有限公司生產，批號13501009)、冰黃膚樂軟膏(西藏芝芝藥業有限公司生產，批號130802)、丹皮酚軟膏(合肥立方制藥股份有限公司生產，批號20130614)、丹皮酚軟膏(吉林吉春制藥股份有限公司生產，批號130763)、復方片仔癀軟膏(漳州片仔癀藥業股份有限公司生產，批號130203)作為陰性樣品，按“1.3.2”項下供試品溶液的制備方法，制備陰性樣品及分別含有17 種目標成分的陽性樣品的供試品溶液。用上述分析條件進行實驗，結果陽性樣品均檢出目標成分，陰性樣品無干擾。陰性樣品和陽性對照的色譜圖見圖2。

圖2 陰性樣品和陽性對照色譜圖Fig.2 Chromatograms of negative sample and positive reference sample

1.4.2 線性關系考察 分別取對照品溶液1、2、4、8、20 μL 進樣，其他分析條件按照“1.2”項中的參數測定，以進樣量(μL)為橫坐標(X)，對照品峰面積積分值為縱坐標(Y)進行線性回歸，相關系數r 均不低于0.99 (n =5)，表明17種糖皮質激素類藥物在0.5 ～10 μg/mL 質量濃度范圍內線性關系滿足篩查需求。

1.4.3 回收率試驗 在陰性樣品中添加17 種糖皮質激素對照品，添加水平為0.1、0.5、1 mg/g，用本方法平行測定5 次。17 種激素的平均回收率在71% ～106%之間，RSD 均小于5%，結果表明，本方法準確度能夠滿足快速篩查的需要。

1.4.4 檢測限 按信噪比(S/N)為3 時計算，17 種糖皮質激素類非法添加物的檢測限均在30 μg/mL以下;按信噪比(S/N)為10 時計算，17 種糖皮質激素類非法添加物的定量限均在100 μg/mL 以下。

1.5 光譜特征 本實驗中的17 種糖皮質激素色譜峰峰頂的光譜吸收圖比較類似且特征明顯，在190 ～400 nm 范圍內只有1 處最大吸收，且最大吸收波長范圍均在241 ～24 6 nm。

2 討論

2.1 非法添加化學藥品要保證其有效性，必須保證添加物的濃度達到藥物的起效濃度，因此添加化學物質的濃度通常較高，容易被分析儀器檢出?？紤]到糖皮質激素類藥物局部外用的臨床治療質量濃度多為0.1 ～2.5 mg/mL［15］，因此本實驗在對照品溶液的選擇上采用了10 μg/mL。

2.2 在流動相的選擇上，本實驗中有9 種糖皮質激素為酯化衍生物，在流動相中加入少量的酸可增加被檢測物質的穩定性。乙腈在紫外區的截止波長范圍優于甲醇，所以選擇了乙腈作為有機相，0.1%甲酸作為水相的流動相組成。

2.3 本實驗采用了配有二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀，在色譜峰達到較好分離的基礎上，可以利用光譜吸收進行初步定性。本實驗中17 種糖皮質激素光譜圖比較簡單且特征明顯，在保留時間和光譜吸收均一致的情況下，假陽性的出現概率是非常低的。

2.4 由于存在某些化學物質與本實驗中的17 種糖皮質激素色譜峰保留時間和光譜吸收相似的可能性，本方法適用于快速篩查，必要時需要用LC-MS和NMR 等設備進行進一步的確認，避免假陽性的判斷。

［1］ 尤啟東. 藥物化學［M］. 北京:化學工業出版社，2004:580-581.

［2］ Parker M. Steroid hormone action ［M］. New York:Oxford，1993.

［3］ 杜 昆. 腎上腺皮質激素的不良反應［J］. 首都醫藥，2000，7(8):62.

［4］ 周 彬，劉 建，朱 靜，等. 糖皮質激素類藥物的不良反應和并發癥［J］. 中國藥業，2002，11(6):43-44.

［5］ 李 森，謝人明，孫文基. 杜仲籽總苷抗糖皮質激素所致小鼠骨質疏松的實驗研究［J］. 中成藥，2010，32(2):205-208.

［6］ 李永清. 糖皮質激素的藥理作用及不良反應［J］. 北方藥學，2013，10(11):32-33.

［7］ Schakman O，Gilson H，Kalista S，et al. Mechanisms of muscle atrophy induced by glucocorticoids［J］. Horm Res，2009，72(Suppl 1):36-41.

［8］ 孫雪婷，商少明，陳秀英，等. 微乳毛細管電色譜電動進樣-場放大堆積法檢測化妝品中糖皮質激素［J］. 分析化學，2014，42(1):36-40.

［9］ 胡擁明，王利兵，袁 媛，等. 糖皮質激素ELISA 檢測方法的建立及群選性抗體的篩選［J］. 食品科學，2009，30(24):331-336.

［10］ 凌 霄，徐志洲，牛 沖. HPLC/MS/MS 法檢測中藥制劑中解熱鎮痛及糖皮質激素類化學藥［J］. 藥物分析雜志，2010，30(7):1311-1314.

［11］ 嚴 華，云 環，劉 鑫，等. UHPLC-LTQ Orbitrap MS測定雞肉組織中5 種糖皮質激素殘留［J］. 分析測試學報，2013，32(8):909-914.

［12］ 李 萌，金勉勉，陳 新，等. 場放大進樣-膠束毛細管電泳法測定化妝品中3 種糖皮質激素［J］. 理化檢驗(化學分冊)，2013，49(4):435-438.

［13］ 夏 瑞，董素英，車寶泉. 薄層色譜法快速鑒別中藥制劑中的糖皮質激素［J］. 藥物分析雜志，2008，28(3):470-471.

［14］ 夏 瑞，車寶泉. RP-HPLC 方法鑒別中藥制劑中的糖皮質激素［J］. 藥物分析雜志，2008，28(2):316-318.

［15］ 吳志華，郭紅衛. 糖皮質激素作用機制進展及在皮膚科中的應用［J］. 皮膚病與性病，2011，33(6):323-324.